විදේශීය DNA දිලීර සෛල තුළට හඳුන්වාදීමේ ක්රම. සෛල තුළට ජාන ලබා දීම. DNA එන්නත් කාර්යක්ෂමතාව වැඩි දියුණු කිරීම සඳහා උපාය මාර්ග
සෛල තුළට ජාන බෙදා හැරීමේ පද්ධති සඳහා වඩාත්ම පොරොන්දු වූ විකල්පයන්ගෙන් එකක් වන්නේ පොලිප්ලෙක්ස් - මාරු කළ DNA සංකීර්ණ සහ විවිධ ස්වභාවයේ කැටායන පොලිමර් ය. මෙම ලිපියෙන් කැටායන බහු අවයවක වර්ග කිහිපයක් මත පදනම් වූ පොලිප්ලෙක්ස් වල ගුණාංග, ඉලක්කගත සෛලවල න්‍යෂ්ටීන් වෙත ඒවා ප්‍රවාහනය කිරීම මෙන්ම මෙම ඉදිකිරීම් භාවිතා කරමින් මාරාන්තික නියෝප්ලාස්ම් වලට ප්රතිකාර කිරීමේ එක් ප්‍රවේශයක් විස්තර කරයි.
හැඳින්වීම
ජාන ප්‍රතිකාරය යනු ජානමය දෝෂ වෙනස් කිරීමට හෝ සෛලවලට නව ක්‍රියාකාරකම් ලබා දීමට අවශ්ය ජානමය ද්රව්ය රෝගියාගේ සෛල තුළට හඳුන්වා දීමෙන් පාරම්පරික, ඔන්කොලොජිකල් සහ වෙනත් රෝග සඳහා ප්රතිකාර කිරීමයි [Gorbunova et al., 1997]. ඉලක්කගත සෛල වෙත DNA හෝ RNA ලබා දීම සඳහා, වාහකයන් (දෛශික) නිර්මාණය කරනු ලබන්නේ ඉහළ මට්ටමේ සංක්‍රමණයක් සහතික කිරීම සඳහා ය, i.e. බාහිර (විදේශීය) DNA හෝ RNA ඇතැම් වර්ගවල සෛල වලට මාරු කිරීම. මීට අමතරව, දෛශික ජානමය තොරතුරු ආරක්ෂා කිරීම සහතික කළ යුතුය, මන්ද vivo තත්ත්‍වයන් යටතේ, න්යෂ්ටික අම්ල බිඳ දමන එන්සයිම, serum nucleases මගින් වේගවත් ක්ෂය වීම හේතුවෙන් විදේශීය DNA අස්ථායී වේ.
ජානමය ද්රව්ය ප්රවාහක වර්ග
ස්වභාවධර්මයේ දී, සෛල වලට ජානමය තොරතුරු ලබා දීම සඳහා විශේෂිත ව්යුහයන් ඇත - වෛරස්. එමනිසා, ඔවුන් ජාන ප්රවාහකයන් ලෙස භාවිතා කිරීමට පටන් ගත්තේය. ඒ අතරම, වෛරස් වාහක භාවිතය සීමාවන් ගණනාවක් ඇත. පළමුව, මෙය මාරු කරන ලද ජානමය ද්රව්යයේ කුඩා ධාරිතාව සහ වෛරස් වල ආවේනික සෛලීය විශේෂත්වයයි. දෙවනුව, එකම ආකාරයේ ආසාදනයක් ගමන් කිරීමේදී ප්‍රතිසංයෝජනයේ ප්රතිඵලයක් ලෙස වෛරස් වල් වර්ගයට නැවත පැමිණීමේ හැකියාව මෙයයි. තෙවනුව, වෛරස් අංශුවල ප්‍රෝටීන ඉතා ප්‍රතිශක්තිකරණ වේ, එහි ප්‍රති result ලයක් ලෙස ඒවා නැවත නැවත පරිපාලනය කිරීම ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතිචාරයක් ඇති කරයි. අවසාන වශයෙන්, වෛරස් වාහකයන් විශාල වශයෙන් නිෂ්පාදනය කිරීම තවමත් තරමක් ගැටළු සහගත සහ මිල අධිකය. වර්තමානයේ, කැටායන ලිපිඩ සහ කැටායන පොලිමර් මත පදනම් වූ වෛරස් නොවන වාහක සඳහා විවිධ විකල්ප ක්රියාකාරීව සංවර්ධනය වෙමින් පවතී. විද්යුත් ස්ථිතික අන්තර්ක්‍රියා හරහා සෘණ ආරෝපිත DNA අණුවක් සහිත ස්වයං-එකලස් නැනෝ සංකීර්ණයන් ස්වයංසිද්ධව සෑදීමට මෙම කැටායන අණු සමත් වේ. කැටායන ලිපිඩ සහ DNA වලින් සමන්විත ස්වයං-එකලස් සංකීර්ණ lipoplexes ලෙස හඳුන්වනු ලබන අතර DNA බහුඅවයව වලින් සමන්විත ඒවා polyplexes ලෙස හැඳින්වේ.
පොලිප්ලෙක්ස් සෑදීමට භාවිතා කරන කැටායන බහු අවයවක
ජාන චිකිත්සාව සහ ජෛව තාක්‍ෂණයේ අරමුණු සඳහා කැටායන බහු අවයවක හෝ පොලිකේෂන් විශාල සංඛ්‍යාවක් යෝජනා කර ඇත. පොලිකේෂන් මගින් DNA සංයුක්ත නැනෝ සංකීර්ණ බවට ඝනීභවනය කරයි, DNA ස්ථායීතාවය සහ න්යෂ්ටික වලින් ආරක්ෂාව සපයයි. කැටායන ප්‍රෝටීන, ඇමයිනෝ අම්ලවල කෘතිම සමජාතීය (පොලිලයිසීන්, පොලිඇර්ජිනීන්), චිටෝසන් පොලිසැකරයිඩ, පොලිඑතිලීන්මින්, විවිධ සංයුතිවල ඩෙන්ඩ්‍රයිමර් සහ වෙනත් වෙනස් කරන ලද බහු අවයවක DNA බන්ධන බහු අවයවක ලෙස සේවය කළ හැකිය. ඩීඑන්ඒ සංයුක්තතාවයේ මට්ටම තීරණය වන්නේ සංකීර්ණයේ සම්පූර්ණ ආරෝපණයෙනි, එය අනෙක් අතට ධනාත්මක පොලිමර් කාණ්ඩ සංඛ්‍යාවේ ඩීඑන්ඒ සෘණ පොස්පේට් කාණ්ඩ ගණනට අනුපාතය මත රඳා පවතී. සාමාන්‍යයෙන්, පොලිප්ලෙක්ස් වල සංයුතියේ, පොලිකේෂන් අතිරික්තයක් ඇති අතර, එහි ප්රතිඵලයක් ලෙස නැනෝ ප්‍රමාණයේ සංකීර්ණ (දස දහස් ගණනක සිට nm කිහිපයක් දක්වා) ඇතිවේ, ඒවා ජලයේ ද්‍රාව්‍ය වන අතර ධන ආරෝපණය වේ (රූපය 1, 2). එසේ නොමැති නම්, සංකීර්ණ අස්ථායී වනු ඇත.
සහල්. 1. කැටායන බහු අවයවක සහ වෘත්තාකාර DNA අණුවක් (ප්ලාස්මිඩ්) වලින් පොලිප්ලෙක්ස් සෑදීමේ යෝජනා ක්රමය. සහල්. 2. සම්ප්‍රේෂණ ඉලෙක්ට්රෝන අන්වීක්ෂය (පරිමාණ බෙදීම 200 nm) භාවිතයෙන් ලබාගත් උපස්ථරයක් මත පොලිප්ලෙක්ස් වල රූපය.
ජාන බෙදාහැරීම සඳහා භාවිතා කරන ලද පළමු පොලිකේෂන් වලින් එකක් වූයේ පොලි-එල්-ලයිසීන් (PL, Fig. 3) වන අතර, එහි පෙප්ටයිඩ ස්වභාවය නිසා ජෛව හායනය වන අතර, එය vivo තුළ භාවිතා කිරීමට අතිශයින්ම පහසු වේ. බොහෝ විට, ඉහළ මතුපිට ආරෝපණ ඝනත්වය හා සම්බන්ධ අනවශ්ය බලපෑම් ඉවත් කිරීම සඳහා, පොලිඑතිලීන් ග්ලයිකෝල් (PEG) සමඟ PL හි copolymer භාවිතා වේ. මෙම වෙනස් කිරීමේ ප්රතිඵලයක් ලෙස, සංකීර්ණයේ මතුපිට ආරෝපණය අඩු වන අතර, එමඟින් පොලිප්ලෙක්ස් මත සෘණ ආරෝපිත සෙරුමය ප්‍රෝටීන් නිශ්චිත නොවන අවශෝෂණය වළක්වන අතර සංකීර්ණවල සයිටොටොක්සිසිටි ද අඩු කරයි.
Polyethylenemine (PEI, Fig. 3) එය මත පදනම් වූ polyplexes නිර්මාණය කිරීම සඳහා polycations සඳහා වඩාත් පොරොන්දු වූ විකල්ප එකක් ලෙස සැලකේ. PEI ආකාර දෙකකින් සංස්ලේෂණය කර ඇත: රේඛීය සහ අතු. PEI සතුව ප්‍රෝටෝනීකරණයට හැකියාව ඇති ඇමයිනෝ සහ ඉමිනෝ කාණ්ඩ විශාල සංඛ්‍යාවක් ඇත, එහි ප්රතිඵලයක් ලෙස එය භෞතික විද්‍යාත්මක තත්ත්‍වයන් යටතේ බෆරින් ගුණ ප්‍රදර්ශනය කරයි. PEI මත පදනම් වූ Polyplexes, PEI මත ඉහළ ආරෝපණ ඝනත්වයක් සහ වඩාත් සංයුක්ත DNA නැමීම් සමඟ සම්බන්ධ වන අනෙකුත් බහුකාරකවලට සාපේක්ෂව න්යෂ්ටික ක්‍රියාකාරිත්වයෙන් වඩාත් කාර්යක්ෂමව මාරු කිරීම සහ ආරක්ෂා කිරීම මගින් සංලක්ෂිත වේ. ප්‍රබල ධන ආරෝපණය PEI හි විෂ වීමට හේතු වන අතර, PEI හි ජීව විද්‍යාත්මක පරිහානිය නොමැතිකම සමඟ, vivo තුළ PEI භාවිතය සඳහා සාධක සීමා කරයි. සයිටොටොක්සිසිටි අඩු කිරීම සඳහා, PEI අඩු විෂ සහිත සහ ඉහළ ජලාකර්ෂණීයතාවයක් ඇති පොලිඑතිලීන් ග්ලයිකෝල් සමඟ වෙනස් කර ඇත.
සහල්. 3. පොලිප්ලෙක්ස් සෑදීමට භාවිතා කරන කැටායන බහු අවයවික, සහ.
ප්‍රවේණික තොරතුරු බෙදා හැරීමේදී භාවිතා කරන පොලිකේෂන් වල තවත් නියෝජිතයෙක් වන්නේ පොලිමිඩොඇමයින් (PAMAM, Fig. 3). මෙම සංයෝග ඉතා අතු බෙදී ඇති ඩෙන්ඩ්‍රයිමර් වේ. අතු බෙදීමට ස්තූතියි, PAMAM වලට විශාල නම්‍යශීලී බවක් ඇත, ඒවා DNA වඩා හොඳ මට්ටමකට සංයුක්ත වන අතර ඒවා මත පදනම් වූ පොලිප්ලෙක්ස් අනෙක් සියල්ලටම වඩා ස්ථායී වේ. එහි ගුණාංග PEI සමඟ බොහෝ පොදු වේ.
Chitosans (රූපය 3) යනු (1>4) ග්ලයිකෝසයිඩ් බන්ධන මගින් සම්බන්ධ කරන ලද D-glucosamine සහ N-acetyl-D-glucosamine වලින් සාදන ලද පොලිසැකරයිඩ වේ. අණුක බර සහ deacetylation උපාධිය මත පදනම්ව, chitosans මාරු කළ DNA සමඟ විවිධ ප්‍රමාණයේ ස්ථායී සංකීර්ණ සාදයි. කුඩා, හෝ අනෙක් අතට, ඉතා විශාල chitosan polymers මාරු කරන ලද ජානයේ ප්රකාශනයේ අඩුවීමක් ඇති කරයි. චිටෝසන් මත පදනම් වූ පොලිප්ලෙක්ස් වල ප්‍රධාන වාසිය වන්නේ ජෛව හායනය වීමයි.
පොලිප්ලෙක්ස් බෙදා හැරීමේ කාර්යක්ෂමතාව බොහෝ සාධක මගින් බලපායි: අණුක බර, අතු බෙදීමේ මට්ටම, බහුඅවයවීකරණය සහ පොලිමර් වර්ගය, අංශු ප්‍රමාණය, ද්‍රාවණයේ අයනික ශක්තිය, සංකීර්ණවල මතුපිට ආරෝපණ මෙන්ම පර්යේෂණාත්මක තත්වයන්. ප්‍රශස්ත ප්රවේශය මෙම එක් එක් සාධක සහ සංකීර්ණයේ ගුණාංග කෙරෙහි ඒවායේ බලපෑම, ඉලක්කගත සෛල මගින් සංකීර්ණ අවශෝෂණය කර ගැනීම සහ විෂ වීම සැලකිල්ලට ගත යුතුය.
ඉලක්කගත සෛල මත පොලිප්ලෙක්ස් වල ක්රියාකාරිත්වයේ නිශ්චිතභාවය සහතික කිරීම සඳහා ප්රවේශයන් කිහිපයක් තිබේ. ඒවායින් එකක් වන්නේ ඇතැම් වර්ගවල සෛල වෙත නැනෝ සංකීර්ණ ඉලක්කගත බෙදාහැරීමයි. මෙම ප්රවේශය ඉලක්කගත සෛලවල මතුපිට විශාල ප්‍රමාණවලින් පවතින බහුප්ලෙක්ස්, ප්‍රතිග්‍රාහක සඳහා සංරචක (ලිගන්ඩ්) ඇමිණීම සමඟ සම්බන්ධ වේ. විවිධ ප්‍රෝටීන, සීනි, පෙප්ටයිඩ, ප්‍රතිදේහ ආදිය විශේෂිත ලිගන්ඩ් ලෙස භාවිතා වේ. තවත් උපාය මාර්ගයක් නම්, ප්‍රවාහනය කළ හැකි ජාන භාවිතා කිරීම, ඇතැම් සෛල තුළ පමණක් සක්‍රීය වන අතර, සංකීර්ණ බෙදා හැරීම නිශ්චිත නොවන ලෙස, එනම් ඕනෑම සෛලයකට සිදු වේ.
ඉලක්කගත සෛල තුළට පොලිප්ලෙක්ස් විනිවිද යාම
ජානමය ද්රව්ය ලබා දීමේ ක්‍රියාවලියට අදියර දෙකක් ඇතුළත් වේ: බාහිර සෛල (එන්නත් කරන ස්ථානයේ සිට ඉලක්කගත සෛල දක්වා මාර්ගය) සහ අන්තර් සෛලීය (ඉලක්ක සෛල සමඟ අන්තර් ක්රියා කිරීම, එන්ඩොසයිටෝසිස්, එන්ඩොසෝම වලින් පිටවීම, න්යෂ්ටිය වෙත බෙදා හැරීම). පොලිප්ලෙක්ස් වල අන්තර් සෛලීය ප්රවාහන මාර්ග රූප සටහන 4 හි දක්වා ඇත.
ඉලක්කගත සෛලය වෙත යන ගමනේදී polyplex හට ජය ගැනීමට අවශ්ය වන පළමු බාධකය වන්නේ රුධිරය සහ බාහිර සෛල අනුකෘතියයි. එහි ස්ථායිතාව වැඩි කිරීම, නිශ්චිත නොවන අන්තර්ක්‍රියා වළක්වා ගැනීම සහ ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතිචාරයක් ඇතිවීමේ හැකියාව වැඩි කිරීම සඳහා සංකීර්ණයේ එවැනි භෞතික රසායනික පරාමිතීන් තෝරා ගැනීම අවශ්ය වන්නේ එබැවිනි. පළමුව, පොලිප්ලෙක්ස් එකක DNA බාහිර සෛල න්යෂ්ටික ක්‍රියාකාරීත්වයෙන් ආරක්ෂා කළ යුතුය. දෙවනුව, සෘණ ආරෝපිත රුධිර සෙරුමය ප්‍රෝටීන (ඇල්බියුමින්, ෆයිබ්‍රිනොජන්, ඉමියුනොග්ලොබුලින්, ආදිය), මෙන්ම බාහිර සෛල අනුකෘතියේ (කොලජන්) ප්‍රෝටීන ආරෝපිත නැනෝ සංකීර්ණවල මතුපිටට අවශෝෂණය කර ගැනීමට හැකි වන අතර එමඟින් මතුපිට ආරෝපණයේ වෙනසක් ඇති වේ. පොලිප්ලෙක්ස්, සංකීර්ණවල විශාලත්වය සහ ඒවායේ එකතුව වැඩි කිරීමට හේතු වේ. පොලිප්ලෙක්ස් ශරීරයට හඳුන්වා දුන් විට, ඒවා අර්ධ වශයෙන් පටක වල එකතු වී ෆාගෝසයිටෝසිස් වලට භාජනය වේ. මෙම හේතූන් නිසා, පොලිප්ලෙක්ස් වල ප්‍රාදේශීය පරිපාලනය (උදාහරණයක් ලෙස, පිළිකාවක ගෙඩියක් බවට) බොහෝ විට භාවිතා කරනුයේ පටක සෛල සමඟ ඒවායේ නිශ්චිත නොවන අන්තර්ක්‍රියා මත ය.
සහල්. 4. පොලිප්ලෙක්ස් ප්‍රවාහනය සඳහා අන්තර් සෛලීය මාර්ග.
Polyplexes ප්‍රථමයෙන් ප්ලාස්මා පටලයට අවශෝෂණය කර, endocytosis මගින් ලබා ගන්නා අතර, ඉන් පසුව ඒවා endolysosomes අත්හැර න්යෂ්ටික ලියුම් කවරය හරහා ගොස් න්යෂ්ටියට ඇතුළු විය යුතුය. සෑම විටම න්යෂ්ටිය වෙත සංකීර්ණ ලබා දීමට හේතු නොවන විකල්ප ප්රවාහන මාර්ග ද ඇත. මීට අමතරව, මාරු කරන ලද ජානයේ ප්රකාශනය සඳහා පොලිප්ලෙක්ස් කැටායන බහුඅවයවයක් සහ නිදහස් DNA බවට විඝටනය කිරීම අවශ්ය වේ.
ඉලක්කගත සෛල වෙත ජානමය ද්රව්ය ලබා දීමේ මීළඟ අදියර වන්නේ ප්ලාස්මා පටලය සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කිරීම සහ සෛලය මගින් අවශෝෂණය කර ගැනීමයි. ඉහත සඳහන් කළ පරිදි, සෘණ ආරෝපිත ප්ලාස්මා පටලය සමඟ විද්යුත් ස්ථිතික අන්තර්ක්‍රියාවල ප්රතිඵලයක් ලෙස ලිගන්ඩ් නොමැති විට සෛලවලට පොලිප්ලෙක්ස් බන්ධනය වීම නිශ්චිතව සිදු නොවේ. බොහෝ අවස්ථාවන්හීදී, එවැනි polyplexes විශේෂිත නොවන adsorptive endocytosis මගින් අවශෝෂණය කර ඇත. සංකීර්ණයට ලිගන්ඩ් ඇතුළත් කිරීමෙන්, ක්ලැත්‍රින් මත යැපෙන ප්‍රතිග්‍රාහක-මැදිහත් වූ එන්ඩොසයිටෝසිස් හරහා අවශෝෂණය ලබා ගත හැක. අනෙකුත් උකහා ගැනීමේ මාර්ග සෛල වර්ගය මත රඳා පවතින අතර phagocytosis සහ caveolin-dependent endocytosis ඇතුළත් වේ. පොලිප්ලෙක්ස් වල සෛලීය බෙදාහැරීම වැඩිදියුණු කිරීමේ එක් උපාය මාර්ගයක් වන්නේ HIV-1 වෛරසයෙන් ප්‍රථමයෙන් හුදකලා වූ TAT පෙප්ටයිඩ වැනි වෛරස් ප්‍රවේශ පෙප්ටයිඩ භාවිතයයි. මෙම අනුපිළිවෙල භාවිතා කිරීම මගින් ඉදිකිරීම් සෛල තුළට ඇතුළු වන අතර සෛල න්යෂ්ටිය තුළට පොලිප්ලෙක්ස් ලබා දීම සහතික කරයි.
පොලිප්ලෙක්ස් වල ප්රවාහන මාර්ගයේ වැදගත්ම අදියර වන්නේ එන්ඩෝසෝම වලින් පිටවීමයි. දන්නා පරිදි, එන්ඩොසෝම යනු අවශෝෂණය කරන ලද සාර්ව අණු වර්ග කිරීම සඳහා අවශ්ය වන නල සහ වෙසිලිකා පද්ධතියකි. වර්ගීකරණ එන්ඩෝසෝම ප්ලාස්මා පටලයට සමීපව පිහිටා ඇත. ප්‍රෝටෝන පොම්ප වල ක්‍රියාකාරිත්වය හේතුවෙන් ඒවායේ pH අගය අඩු වේ (එන්ඩෝසෝම වර්ග කිරීමේදී 6.5 ක් පමණ). ප්‍රමාද එන්ඩොසෝම වල පරිසරය තවදුරටත් ආම්ලික වීම සිදු වූ විට සහ සාර්ව අණු ලයිසොසෝම වලට ඇතුල් වන විට අවශෝෂිත අණු බාහිර අවකාශයට මුදා හැරීමත් සමඟ ප්‍රතිචක්‍රීකරණ මාර්ගය ඔස්සේ හෝ ලයිටික් මාර්ගය ඔස්සේ තවදුරටත් ප්‍රවාහනය සිදු විය හැක. ලයිසොසෝම වල, අන්තර්ගතය pH 5 දක්වා ආම්ලික කර ඇති අතර, අඩු pH අගයකදී සක්‍රීය වන ජලවිච්ඡේදක එන්සයිම මගින් අවශෝෂණය කරන ලද අණු ක්ෂය වේ. දිරාපත්වන නිෂ්පාදන එක්සොසිටෝසිස් මගින් සෛලයෙන් ඉවත් කරනු ලැබේ හෝ සයිටොප්ලාස්මයට මාරු කරනු ලැබේ, එහිදී ඒවා ගොඩනැගිලි ද්රව්ය ලෙස භාවිතා කරයි.
PEI මත පදනම් වූ පොලිප්ලෙක්ස්, ඒවායේ ගුණාංග නිසා, ඊනියා "ප්‍රෝටෝන ස්පොන්ජ් ආචරණය" හේතුවෙන් එන්ඩොසෝම වලින් පිටවීමට හැකියාව ඇති බව විශ්වාස කෙරේ. මෙම උපකල්පනය පදනම් වී ඇත්තේ ප්‍රෝටෝන නොවන ද්විතියික සහ තෘතියික ඇමයින පැවතීම හේතුවෙන් කැටායන බහු අවයවික ස්වාරක්ෂක ආචරණයක් නිර්මාණය කරන අතර එහි ප්රතිඵලයක් ලෙස ප්‍රෝටෝන එන්ඩොසෝම වලට පොම්ප කරන H±ATPase වඩාත් ක්රියාකාරීව ක්රියා කිරීමට පටන් ගනී. මෙම අවස්ථාවේ දී, ක්ලෝරීන් ඇනායන එන්ඩෝසෝම තුළ එකතු වේ. එහි ප්රතිඵලයක් වශයෙන්, ඔස්මොටික් පීඩනයෙහි තියුණු වැඩිවීමක් හේතුවෙන් ඉදිමීම සහ ලිස්සා යාම සිදු වන අතර එමඟින් පොලිප්ලෙක්ස් වලට සයිටොසෝල් නොවෙනස්ව ඇතුළු වීමට ඉඩ සලසයි. එන්ඩෝසෝම වලින් පිටවීම සඳහා තවත් යාන්ත්‍රණයක් පොලිප්ලෙක්ස් සඳහා යෝජනා කර ඇති අතර, නැනෝ සංකීර්ණවල ඉහළ මතුපිට ආරෝපණ ඝනත්වය හේතුවෙන් එන්ඩෝසෝම පටලය අස්ථාවර කිරීම ඇතුළත් වේ. PL සහ chitosan මත පදනම් වූ සංකීර්ණ "ප්‍රෝටෝන ස්පොන්ජ්" ආචරණය ඇති නොකරන අතර එන්ඩෝසෝම පටලය අස්ථාවර කිරීමට අඩු හැකියාවක් ඇති අතර එමඟින් බොහෝ අඩු සම්ප්‍රේෂණ කාර්යක්ෂමතාවයක් ඇති කරයි.
ලයිසොසෝම වලින් ඉවත් වූ පසු, පොලිප්ලෙක්ස් පෙරනියුක්ලියර් අවකාශයේ සිටින අතර ඉන් පසුව සංකීර්ණය නිදහස් පොලිකේෂන් සහ ඩීඑන්ඒ බවට විඝටනය වේ. DNA වල පොස්පේට් කාණ්ඩ සහ සයිටොප්ලාස්මයේ අඩු අණුක බර සංයෝග සහ ඇනායන අතර කැටායන කාණ්ඩ සඳහා තරඟය හේතුවෙන් මෙය සිදු වන බව විශ්වාස කෙරේ. සමහර අවස්ථාවලදී, සංකීර්ණයේ විඝටනය පැහැදිලිවම න්යෂ්ටිය තුළ සිදු වේ. ප්ලාස්මිඩ් DNA සෛල න්යෂ්ටිය තුළට ගමන් කිරීමේ ප්‍රධාන බාධකය වන්නේ ද්විත්ව න්යෂ්ටික ලියුම් කවරයයි. සාර්ව අණු න්යෂ්ටිය තුළට ලබා දීම සඳහා, ඒවාට න්යෂ්ටික ස්ථානගත කිරීමේ අනුපිළිවෙලක් (NLS) ඇතුළත් වන අතර, එය α- සහ β-importins සමඟ ඒකාබද්ධව, න්යෂ්ටික සිදුරු සංකීර්ණය (NPC) මගින් හඳුනාගෙන න්යෂ්ටිය තුළට ක්රියාකාරීව විනිවිද යයි. නිෂ්ක්‍රීය විසරණය මගින් NPC හරහා ගමන් කළ හැක්කේ කුඩා අණුවලට පමණි (<40 кД, ~10 нм). Так как освободившаяся после распаковывания комплекса свободная плазмидная ДНК не имеет последовательности ядерной локализации, то в ядро будет проходить очень незначительная часть плазмид (не более 0,1–0,001%). Кроме того, установлено, что около 50% инъецированной ДНК деградирует в цитозоле уже через 1–2 часа после введения . Но т.к. клетки опухолей, против которых и направлена генная терапия, отличаются активной пролиферацией, то ДНК без труда проникает в ядра дочерних клеток во время митотического цикла, когда ядерная оболочка демонтирована.
චිකිත්සක ජානවල ක්රියාකාරිත්වයේ යාන්ත්රණ
ප්ලාස්මිඩය න්යෂ්ටියට ඇතුල් වීමෙන් පසුව, චිකිත්සක ජානයේ ප්රකාශනය ආරම්භ වේ. පොලිප්ලෙක්ස් වල ක්‍රියාකාරිත්වයට නිශ්චිතභාවයක් ලබා දීම සඳහා, ප්ලාස්මිඩයේ ඇති චිකිත්සක ජානය ප්‍රවර්ධකයෙකුගේ පාලනය යටතේ තබා ඇත (පිටපත් කිරීමට පෙර RNA පොලිමරේස් පතිත වන ජානයේ කලාපය), එය පිළිකා පටක වල පමණක් ක්රියාකාරී වේ. උදාහරණ ලෙස ප්‍රති-ඇපොප්ටෝටික් ප්‍රෝටීන් සර්විවින් සඳහා ජානයේ ප්‍රවර්ධකයා හෝ ටෙලමරේස් එන්සයිම සඳහා ජාන ඇතුළත් වේ. හර්පීස් සිම්ප්ලෙක්ස් වෛරස් තයිමිඩින් කයිනේස් (HSVtk) ජානය, ප්‍රති-හර්පීස් සංයෝග ඇසික්ලොවර් සහ ගන්සික්ලොවර් යන සංයෝග පොස්පරීකරණය කිරීමේ හැකියාව ඇත, එය චිකිත්සක ජානයක් ලෙස භාවිතා කළ හැකිය. මෙම සංයෝග ටික වේලාවකට පසු ගෙඩියට එන්නත් කරනු ලැබේ. ඊළඟට, සෛලීය කයිනේස් (ෆොස්ෆොරයිලේටින් එන්සයිම) ෆොස්ෆොරයිලේටඩ් ඇසික්ලොවර් හෝ ගැන්සික්ලොවර් ට්‍රයිපොස්පේට් බවට පරිවර්තනය කරයි, ඒවා සෛල බෙදීමේදී දෙගුණ කිරීමේදී අලුතින් සංස්ලේෂණය කරන ලද DNA වලට ඇතුළත් කර එහි සංශ්ලේෂණය අවසන් කරයි. එහි ප්රතිඵලයක් වශයෙන්, තයිමිඩින් කයිනාස් ජානය න්යෂ්ටිය තුළට ඇතුළු වී ඇති සෛල මෙම ද්රව්ය හමුවේ විනාශ වේ. මෙම අවස්ථාවේ දී, එය DNA සංස්ලේෂණය නොකරන අතර ganciclovir හෝ acyclovir ඇතුළත් නොවන අතර, මිය යන්නේ බෙදුම් සෛල මිස විවේක ගන්නා සෛල නොවේ. චිකිත්සක ජානයක ක්‍රියාකාරීත්වයේ මෙම යාන්ත්‍රණය සෛල වේගයෙන් බෙදෙන පිළිකා පිළිකා සඳහා ජාන ප්රතිකාර සඳහා භාවිතා කළ හැකිය.
යොමු:
- Gorbunova V.N., Baranov V.S. පාරම්පරික රෝග පිළිබඳ අණුක රෝග විනිශ්චය සහ ජාන චිකිත්සාව හැඳින්වීම. S.-Pb., "විශේෂ සාහිත්යය", 1997, p.287.
- Dunlap D.D., Maggi A., Soria M.R., Monaco L. ජාන බෙදාහැරීම සඳහා ඝනීභවනය කරන ලද DNA වල නැනෝස්කොපික් ව්යුහය. // Nucl. අම්ල. Res., 1997, vol. 25, 3095-3101.
- Park T.G., Jeong J.H., Kim S.W. බහු අවයවික ජාන බෙදාහැරීමේ පද්ධතිවල වත්මන් තත්ත්වය. // Adv. ඖෂධ ඩෙලිව්. Rev., 2006, vol. 58, 467-486.
- Pack D. W., Hoffman A. S., Pun S. සහ Stayton P. S. ජාන බෙදා හැරීම සඳහා බහු අවයවක සැලසුම් කිරීම සහ සංවර්ධනය කිරීම. // Nature Rev., Drug Discovery, 2005, vol. 4,581.
- Lechardeur D., Verkman A.S., Lukacs G.L. වෛරස් නොවන ජාන මාරු කිරීමේදී ප්ලාස්මිඩ් DNA අන්තර් සෛලීය මාර්ගගත කිරීම. // Adv. ඖෂධ ඩෙලිව්. Rev., 2005, vol. 57, 755-767.
- මැක්ස්ෆීල්ඩ් එෆ්.ආර්. සහ මැක්ග්රෝ ටී.ඊ. එන්ඩොසයිටික් ප්රතිචක්රීකරණය. // Nature Rev. මෝල්. සෛලය. Biol., 2004, vol. 5, 121-132.
- Reid R., Eng-Chung M., Eng-Chang H. සහ Topal M.D. හර්පීස්විරිඩේ, මානව ඇල්ෆා සහ මානව බීටා පොලිමරේස් මගින් ඇසික්ලික්, ඩයිඩොක්සි සහ ආරා නියුක්ලියෝටයිඩ ඇතුළත් කිරීම සහ දිගු කිරීම. // J. Biol. රසායන., 1988, වෙළුම. 263, 3898-3904.
ඩුරිමානොව් මිහායිල්, මොස්කව් රාජ්ය විශ්ව විද්යාලයේ ජීව විද්යා පීඨයේ ශිෂ්ය
ලිපිය ලොමොනොසොව් 2009 සම්මන්ත්‍රණයේ ජනප්‍රිය විද්යා තරඟයේ ත්‍යාගලාභී වේ (ජීව විද්යා පීඨය, "නැනෝ ජෛව තාක්ෂණය", "ජෛව ඉංජිනේරු", "ජෛව භෞතික විද්‍යාව" යන අංශ.
ආචාර්ය පීටර් ඩොනොවන් ගේ මඟපෙන්වීම යටතේ කැලිෆෝනියා විශ්ව විද්යාලයේ විද්‍යාඥයින් විසින් සකස් කරන ලද සහ කලල ප්රාථමික සෛල හැසිරවීමේ දන්නා ක්රම දෙකක එකතුවක් මත පදනම් වූ මෙම තාක්ෂණය මානව කලල ප්රාථමික සෛල වෙත DNA ලබා දීමේ කාර්යක්ෂමතාව දෙගුණ කරයි.
රසායනික සංක්‍රමණය, නියුක්ලියෝෆෙක්ෂන් සහ විද්යුත් විච්ඡේදනය භාවිතා කරමින් hESC වලට DNA හඳුන්වා දීමේ නවීන ක්රම බරපතල අඩුපාඩුවක් ඇත - අඩු කාර්යක්ෂමතාව. වෛරස් ආසාදනයක් භාවිතා කරමින් HESC වලට ජානමය ද්රව්ය ලබා දීම වඩාත් ඵලදායී වන නමුත් ප්රාථමික සෛල සඳහා අනවශ්ය ප්‍රතිවිපාක රාශියක් ඇති අතර සෛල තවදුරටත් බද්ධ කිරීම සඳහා අදහස් කරන්නේ නම් වෛද්ය දෘෂ්ටි කෝණයකින් සම්පූර්ණයෙන්ම ආරක්ෂිත යැයි හැඳින්විය නොහැක.
තනි ප්රාථමික සෛලයක නියුක්ලියෝෆෙක්ෂනයේ එකතුවක් මත පදනම් වූ නව තාක්‍ෂණයක් සහ ප්රතිඵලයක් ලෙස සම්ප්රේෂණය වන ජනපද තෝරා ගැනීම සඳහා ප්‍රශස්ත ක්‍රමයක් සෛල තුළ සංක්‍රාන්ති ජානවල කාලෝචිත සහ ස්ථායී ප්රකාශනය සහතික කරයි. නියුක්ලියෝෆෙක්ෂන් යනු විද්යුත් ආවේග භාවිතයෙන් සෛල පටලයේ සිදුරු සෑදීම සහ පසුව DNA සෛලයට හඳුන්වා දීමයි.
උනන්දුව දක්වන ජානයට අමතරව, නවීකරණය කරන ලද DNA නිර්මිතය පරිවර්තනය කළ සෛලය පහසුවෙන් ලුහුබැඳීමට ඉඩ සලසන ජානයක් දරයි, උදාහරණයක් ලෙස, ජාන කේතනය කරන මානවකරණය වූ Renilla green fluorescent protein (hrGFP). සෛල ලේබල් කිරීමේ මෙම ක්රමය මඟින් පරිණාමනය වූ සෛල සතුන්ට බද්ධ කරන විට ඒවායේ චලනය නිරීක්ෂණය කිරීමට හැකි වේ.
විභවය ලෙස, මෙම ක්රමය රෝගී පුද්ගලයෙකුගේ සියලුම සෛලවල එක් ජානයක විකෘති වීම නිසා ඇති වන මොනොජනික් රෝග සඳහා ප්රතිකාර කිරීම සඳහා ප්‍රයෝජනවත් විය හැකිය. ලෝක සෞඛ්ය සංවිධානයට අනුව, මිනිස් රෝග 10,000 කට වඩා වැඩි ප්‍රමාණයක් ඒකජනක ස්වභාවයක් ගනී. ලොව පුරා මිලියන සංඛ්‍යාත ජනතාවක් හන්ටිංටන්ගේ රෝගය, දෑකැති සෛල රක්තහීනතාවය, හිමොෆිලියා සහ සිස්ටික් ෆයිබ්‍රෝසිස් ඇතුළු මොනොජනික් රෝගවලින් පීඩා විඳිති.
නව ක්රමය මඟින් HES සෛල හැසිරවීමේ හැකියාව පුළුල් වන අතර එමඟින් මිනිස් රෝග ආදර්ශයට ගැනීමට සහ සුදුසු ඖෂධ සොයා ගැනීමට හැකි වේ. මෙම තාක්ෂණය භාවිතා කරමින්, ප්රාථමික සෛලවල ජානමය ආබාධ නිවැරදි කිරීමට සහ ප්රතිජනන වෛද්ය විද්යාවේදී සෞඛ්ය සම්පන්න සෛල භාවිතා කිරීමට විද්යාඥයින්ට හැකි වනු ඇත.
හරිත ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රෝටීන hrGFP ප්‍රකාශ කරන HES සෛල ජනපදය.
Hohenstein KA et al විසින් ලිපිය. “Nucleofection Mediates High-efficiency Stable Gene Knockdown and Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cells” සඟරාවේ මාර්ගගත අනුවාදයෙන් ලබා ගත හැකිය. ප්රාථමික සෛල 2008 මාර්තු 6 සිට.
බැක්ටීරියා සෛලයකට ප්රතිසංයෝජන DNA හඳුන්වාදීමේ ක්රියාවලිය ලෙස හැඳින්වේ පරිවර්තනය. පරිවර්තනයේ ප්‍රතිඵලය වන්නේ නව DNA අනුපිළිවෙලවල් ධාරක සෛලය විසින් අත්පත් කර ගැනීම සහ එහි ප්රතිඵලයක් ලෙස, නව ෆීනෝටයිපික් ලක්ෂණ, උදාහරණයක් ලෙස, ඇතැම් ප්රතිජීවක වලට ප්රතිරෝධය දැක්වීමයි. එවැනි අත්හදා බැලීම් වලදී භාවිතා කරන ධාරක සෛලයට විශේෂයෙන් නිශ්චිත සංසිද්ධියක් තිබිය යුතුය r-, i.e. එය සීමා කිරීමේ එන්සයිම අඩංගු නොවිය යුතුය; එය සාමාන්‍ය නැවත ඒකාබද්ධ කිරීමට නොහැකි විය යුතුය ( recA-)ඒ නිසා බාහිර DNA සමජාතීය ප්‍රතිසංයෝජනයකින් වෙනස් නොවේ. මෙම අරමුණු සඳහා බහුලව භාවිතා වන සංස්කෘතියක් වන්නේ බැක්ටීරියා වල රසායනාගාර වික්‍රියාවකි E.coli- වික්‍රියා K12.
විදේශීය DNA ලබා ගත හැකි සෛල ලෙස හැඳින්වේ දක්ෂ.නිපුණතාවය E. coliප්‍රේරණය කළ යුතු අතර, තවත් සමහර බැක්ටීරියා මෙම ගුණය සහජයෙන්ම ඇත. විශේෂ පෝෂක මාධ්යයක් හෝ සංස්කෘතික තත්වයන් භාවිතා කිරීමෙන් දක්ෂ සෛලවල අනුපාතය වැඩි කළ හැක. නිපුණතාවයේ රසායනික ප්‍රේරක වලට ප්‍රතිරෝධී හෝ ස්වාභාවික නිපුණතා නොමැති බැක්ටීරියා සඳහා, වෙනත් DNA බෙදාහැරීමේ පද්ධති භාවිතා වේ.
රසායනාගාර භාවිතයේදී බැක්ටීරියා සෛල පරිවර්තනය කිරීම සඳහා බහුලව භාවිතා වන ක්රම වනුයේ:
පරිවර්තනය E.coliකැල්සියම් ක්ලෝරයිඩ් සමඟ ප්රතිකාර කිරීමෙන්;
විද්යුත් විච්ඡේදනය- වත්මන් ස්පන්දනයක බලපෑම යටතේ සෛල පාරගම්යතාව වැඩි වීම ~ 4.5 ms;
පරිවර්තනයේ ප්‍රතිඵල ප්‍රමාණාත්මකව තක්සේරු කළ හැක: එක්කෝ තීරණය කිරීමෙන් සංඛ්යාතය, හෝ කාර්යක්ෂමතාවපරිවර්තනය.
පරිවර්තන සංඛ්යාතය- විදේශීය DNA ලැබුණු සෛල ජනගහනයේ සෛල අනුපාතය; මුළු සෛල ගණනට පරිවර්තන සංඛ්යාවෙන් ප්රකාශිත වේ.
පරිවර්තන කාර්යක්ෂමතාව- පරිවර්තනය සඳහා ගන්නා ලද DNA 1 μg සඳහා පරිවර්තක ගණන.
මෙම කොටසේ ඉදිරිපත් කර ඇති ප්ලාස්මිඩ් දෛශික pBR322 භාවිතයෙන් ප්රතිසංයෝජක DNA ක්ලෝන කිරීම පිළිබඳ තොරතුරු පර්යේෂණාත්මක රූප සටහනක ආකාරයෙන් සාරාංශ කර රූප සටහන 20 හි ඉදිරිපත් කර ඇත.
සහල්. 20. pBR322 ප්ලාස්මිඩ් දෛශිකයේ DNA ක්ලෝනකරණය
1, 2, 3, 4 සහ 5 - ක්ලෝනකරණ ක්රියා පටිපාටියේ අදියර (පෙළ බලන්න).
1. pBR322 DNA ඇම්පිසිලින් ප්රතිරෝධය තීරණය කරන කලාපයේ සීමා සහිත endonuclease PstI සමඟ කපා ඇත.
2. PstI භාවිතයෙන් ලබාගත් සහ රේඛීය දෛශික pBR322 වැනි ඇලෙන සුළු කෙළවර ඇති පරිත්‍යාගශීලීන්ගේ DNA කොටස් DNA ligase භාවිතයෙන් දෛශික DNA සමඟ සම්බන්ධ වේ. එවැනි ඉදිකිරීමක් සෑදීමේ ප්රතිවිපාකය වන්නේ ඇම්පිසිලින් වලට ප්රතිරෝධය සපයන ජානය විනාශ කිරීමයි. මේ අනුව, සෛල තුළට හඳුන්වා දුන් විට නිර්මාණය කරන ලද ප්රතිසංයෝජන DNA E.coliඇම්පිසිලින් සමඟ මාධ්යයක් මත ඔවුන්ගේ පැවැත්ම සහතික කිරීමට නොහැකි වනු ඇත.
3. සෛල E.coliප්රතිසංයෝජක DNA සමඟ පරිවර්තනය කර ඇත.
4. පරිවර්තන ක්රියාපටිපාටිය පසු සෛල අත්හිටුවීම agar තහඩු සහ ප්රතිජීවක ටෙට්රාසයික්ලයින් අඩංගු පෝෂක මාධ්යයක් මත වපුරා ඇත. මෙම අදියරේදී, තේරීම සිදු වේ, i.e. ටෙට්රාසයික්ලයින් සහිත මාධ්යයක් මත වර්ධනය විය හැකි සෛල තෝරා ගැනීම. මෙම agar මත වැඩෙන සෛල ප්රතිසංයෝජක DNA සහ pBR322 DNA අඩංගු වන අතර, දායකයාගේ DNA ඇතුළු කිරීම ඒකාබද්ධ කර නොතිබුණි, i.e. දෛශිකයේ මුල් ව්යුහය ප්රතිෂ්ඨාපනය කරන ලදී.
5. තනි සෛල ජනපද E.coli, ටෙට්රාසයික්ලයින් සමඟ පිඟානක් මත වැඩී, තහඩු දෙකක් මත උපසංස්කෘතික කර ඇති අතර, ඉන් එකක් ඇම්පිසිලින් සමඟ ආගාර් සහ දෙවැන්න ටෙට්රාසයික්ලයින් සමඟ ඇත. ප්රතිසංයෝජක ප්ලාස්මිඩ් DNA අඩංගු සෛල වර්ධනය වන්නේ ටෙට්රාසයික්ලයින් ඒගාර් මත පමණි, මන්ද ඇම්පිසිලින් වලට ප්රතිරෝධය සපයන ජානය පරිත්‍යාගශීලීන්ගේ DNA ඇතුල් කිරීම නිසා විනාශ වේ. මුල් පිටපත සමඟ සෛල අතර, i.e. ප්රතිසාධනය කරන ලද දෛශික DNA pBR322 ප්රතිජීවක දෙකටම ප්රතිරෝධය දැක්වීමේ ජාන ස්වදේශිකයේ ඇති බැවින් තහඩු දෙකෙහිම වර්ධනය වේ, i.e. එහි මුල් තත්වයේ.
තෝරාගත් ක්ලෝන වල සෛල වලින් E.coliප්ලාස්මිඩ් DNA නිස්සාරණය කර එහි ව්යුහය විශ්ලේෂණය කරයි.
අනෙකුත් ප්ලාස්මිඩ් දෛශික
විසිවන සියවසේ 80 දශකයේ ආරම්භයේ දී බොලිවර් සහ රොඩ්රිගස් විසින් ආරම්භ කරන ලද pBR322 දෛශිකයේ යුගය අද දක්වාම පවතී. කෙසේ වෙතත්, එහි සියලු විශ්වසනීයත්වය සහ දෛශික සඳහා අවශ්ය සියලුම අවශ්‍යතා සමඟ සම්භාව්‍ය අනුකූලතාවය සඳහා, මෙම දෛශිකයට ඇත්තේ ක්ලෝන කිරීම සඳහා පහසු අඩවි කිහිපයක් පමණි. ඊට අමතරව, එය මත පදනම් වූ ප්රතිසංයෝජන DNA සමඟ අත්හදා බැලීම් වලදී පරිවර්තනය කළ සෛල තෝරා ගැනීමට බොහෝ කාලයක් ගතවේ. විකල්ප, වඩා දියුණු ක්ලෝන පද්ධති සංවර්ධනය කිරීමේ අවශ්‍යතාවයක් ඇති විය. මේ අනුව, pUC පවුලේ දෛශික සමූහයක් නිර්මාණය කරන ලදී. මෙම පවුලේ දෛශිකයන්ගේ නම්වල "U" සහ "C" යන අකුරු වචනවල මුල් අකුරු වේ. කැලිෆෝනියා විශ්ව විද්යාලය. මෙම විශ්ව විද්යාලයේ පර්යේෂකයන් විසින් වැදගත් ලක්ෂණයක් ඇති දෛශික මාලාවක් නිර්මාණය කරන ලදී - DNA ව්යුහයේ කෘතිම ප්‍රෝටීනයක් තිබීම. පොලිලින්කර්, එය ලබා දී ඇති දෛශිකයකට අනන්‍ය වූ සීමා කිරීම් අන්තරාසර්ග ගණනාවක් සඳහා හඳුනාගැනීමේ ස්ථාන වලින් සමන්විත නියුක්ලියෝටයිඩ අනුපිළිවෙලකි - MCS (බහු ක්ලෝන අඩවි). pUC පවුලෙන් තනි දෛශිකයන්ගේ නම් ඉලක්කම් දෙකක සංඛ්‍යාවකින් වෙනස් වන අතර විවිධ දෛශිකවල ප්රාථමික ව්යුහය MCS අඩවි MCS සංයුතියට වෙනස් වේ - බහු ලින්කර්හි බහු ක්ලෝන අඩවි.
උදාහරණයක් ලෙස pUC19 දෛශිකය භාවිතා කරමින් මෙම කණ්ඩායමට ඇතුළත් කර ඇති දෛශිකවල ලක්ෂණ වඩාත් විස්තරාත්මකව සලකා බලමු (රූපය 21).
Plasmid pUC19 දිග 2686 bp වේ. සහ අඩංගු වන්නේ: ampicillin ප්රතිරෝධය ජානය; β-galactosidase ජානයේ නියාමනය කරන ලද කොටස (lacZ")ලැක්ටෝස් ඔපෙරෝන් E. coliජානය lacI,ජාන ප්රකාශනය පාලනය කරන මර්දනකාරකයක් කේතනය කිරීම lacZ"; polylinker - endonucleases (EcoRI, SacI, KrpI, XmaI, SmaI, BamHI, XbaI, SalI, HincII, AccI, BspMI, PstI, SphI සහ HindIII) සඳහා බොහෝ අනන්‍ය හඳුනාගැනීමේ අඩවි සහිත කෙටි අනුපිළිවෙලක්; ColE1 ප්ලාස්මිඩයේ අනුකරණයේ සම්භවය.
සහල්. 21. ප්ලාස්මිඩ් දෛශික pUC19
සිතියම පිළිබඳ පැහැදිලි කිරීමක් පෙළෙහි දක්වා ඇත.
ඇම්පිසිලින් වලට ප්රතිරෝධය සපයන pUC19 ප්ලාස්මිඩයේ ජානයක් තිබීම මෙම ප්රතිජීවක සමඟ පෝෂක මාධ්‍ය මත පදනම්ව මෙම දෛශිකය හෝ ප්රතිසංයෝජක DNA අඩංගු E. coli ක්ලෝන තෝරා ගැනීමට ඉඩ සලසයි. ලෙස සලකා බලනු ලබන දෛශිකයේ ව්යුහයේ එවැනි මොඩියුලර් මූලද්රව්ය lacZ", lacIසහ MCS මගින් ප්රතිසංයෝජක DNA සමඟ ක්ලෝන තෝරා ගැනීමේ ක්රියා පටිපාටිය වේගවත් කිරීමට සහ තීව්‍ර කිරීමට හැකි වේ.
නවීකරණය නොකළ pUC19 ප්ලාස්මිඩය අඩංගු සෛල ප්‍රේරකයක් වන isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) ඉදිරියේ වර්ධනය වේ නම් ලක්-ඔපෙරෝන්, පසුව ජාන නිෂ්පාදනය lacI,ඊනියා මර්දනය කරන්නා, ජානයේ ප්‍රවර්ධක-ක්‍රියාකරු කලාපය සම්බන්ධ කර ගැනීමට නොහැකි වනු ඇත lacZ",සහ එහි ප්රතිඵලයක් වශයෙන්, ප්ලාස්මිඩ් ජාන කොටසෙහි පිටපත් කිරීම සහ පරිවර්තනය සිදුවනු ඇත lacZ".මෙම කොටසෙහි නිෂ්පාදිතය වර්ණදේහ DNA මගින් කේතනය කරන ලද ප්‍රෝටීනයකට බන්ධනය වේ ( α-අනුපූරකය), සහ එහි ප්රතිඵලයක් ලෙස ක්රියාකාරී ß-galactosidase පිහිටුවා ඇත. බහු සීමා කිරීම් ස්ථාන (පොලිලින්කර්) සහිත අනුපිළිවෙලක් ජානයට ඇතුල් කරනු ලැබේ lacZ"එය ක්රියාකාරී β-ග්ලැක්ටොසිඩේස් නිෂ්පාදනයට බලපාන්නේ නැති අතර, එහි උපස්ථරය 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) මාධ්‍යයේ තිබේ නම්, එය ජල විච්ඡේදනය වේ. මෙම එන්සයිමය මගින් වෙනස් නොකළ සෛලවල ජනපද පැල්ලම් කරන නිල් නිෂ්පාදනයක් සෑදීම සමඟ, i.e. විදේශීය DNA ඇතුල් කිරීමකින් තොරව, ප්ලාස්මිඩ් pUC19 (රූපය 22).
සහල්. 22. pUC19 දෛශිකයේ DNA ක්ලෝනකරණ ක්රියා පටිපාටි අනුපිළිවෙල.
1, 2, 3 සහ 4 - ක්ලෝන කිරීමේ අදියර (පෙළ බලන්න)
1. පරිත්‍යාගශීලීන්ගේ DNA සීමා කිරීමේ අන්තරාසර්ග වලින් එකක් සමඟ ප්රතිකාර කරනු ලැබේ, ඒ සඳහා පොලිලින්කරයේ අඩවියක් ඇත. pUC19 දෛශික DNA එකම එන්සයිම සමඟ ප්රතිකාර කරනු ලැබේ
2. රේඛීය දෛශිකය බන්ධනය කිරීම සහ T4 DNA ligase භාවිතයෙන් ඇතුල් කිරීම.
3. ඉන්කියුබේෂන් මිශ්‍රණයක් සමඟ බන්ධන ක්රියා පටිපාටියෙන් පසුව, α-පූරණය කිරීමේ හැකියාව ඇති සෛල පරිවර්තනය වේ, එමඟින් ජාන නිෂ්පාදනය සමඟ ඒකාබද්ධ වන ß-galactosidase (LacZα) කොටස සංස්ලේෂණය කළ හැකිය. lacZ"ක්රියාකාරී එන්සයිමයක් සෑදීමත් සමග.
4. ප්රතිකාර කරන ලද සෛල ඇම්පිසිලින්, IPTG සහ ß-galactosidase සඳහා උපස්ථරයක් සහිත පෝෂක මාධ්යයක් මත ආලේප කර ඇත. පරිවර්තනය නොකළ සෛල ඇම්පිසිලින් ඉදිරියේ වර්ධනය විය නොහැකි අතර, නොවෙනස්ව ප්ලාස්මිඩයක් රැගෙන යන සෛල ඇම්පිසිලින් සහිත මාධ්යයක් මත නිල් ජනපද සාදයි. දෙමුහුන් රැගෙන යන ධාරක සෛල, i.e. recombinant plasmid එකම මාධ්යයක් මත සුදු ජනපද සාදයි. මෙයට හේතුව සාමාන්‍යයෙන් විදේශීය DNA බහු ලින්කර් එකකට ඇතුළු කළ විට සම්පූර්ණ ජාන නිෂ්පාදනයක් සෑදිය නොහැකි වීමයි. lacZ", සහ, එබැවින්, α-අනුපූරක ක්‍රියාවලියේදී, සක්‍රීය ß-galactosidase සෑදෙන්නේ නැත, එමඟින් X-Gal උපස්ථරය නිෂ්පාදනයක් වෙත විවර කරයි, එමඟින් යටත් විජිත සෛල නිල් පැහැයෙන් වර්ණ ගැන්වීම සහතික කෙරේ.
බැක්ටීරියාභක්ෂක λ මත පදනම් වූ වාහකයන්
ප්ලාස්මිඩ් වාහකයන් 10 kb නොඉක්මවන DNA කොටස් ක්ලෝන කිරීමට ඉඩ දෙයි. කෙසේ වෙතත්, කුඩා ජීවියෙකුගේ පවා වර්ණදේහ DNA ක්ලෝන කිරීම පිළිබඳ ගැටළුව විසඳීම සඳහා, උදාහරණයක් ලෙස බැක්ටීරියාවක්, මෙම DNA කොටස්වල සම්පූර්ණ එකතුවක් නිර්මාණය කිරීම අවශ්ය වේ, එබැවින් බොහෝ විට විශාල කොටස් සමඟ වැඩ කිරීම අවශ්ය වේ. මෙම කාර්යය සඳහා, බැක්ටීරියාභක්ෂක λ මත පදනම් වූ වාහකයන් සංවර්ධනය කරන ලදී ඊ. coli
E. coli සෛල තුළට phage λ විනිවිද යාමේදී. සිදුවීම් වර්ධනය කිරීමේ විකල්ප ක්රම දෙකක් තිබේ:
1. ලයිටික් චක්රය- ෆේජ් සක්‍රීයව ගුණ කිරීමට පටන් ගන්නා අතර මිනිත්තු 20 කට පමණ පසු නව ෆේජ් අංශු 100 ක් දක්වා මුදා හැරීමත් සමඟ සෛලය විනාශ වේ.
2. lysogeny තත්ත්වය- phage DNA E. coli වර්ණදේහයේ prophage ලෙස ඇතුළත් කර ඇති අතර සාමාන්‍ය බැක්ටීරියා සෛල සමඟ සෛලය තුළ ප්‍රතිවර්තනය වේ. කෙසේ වෙතත්, අහිතකර තත්වයන් යටතේ (පෝෂණය නොමැතිකම), ලයිටික් චක්රය ආරම්භ වේ (රූපය 23):
1. bacteriophage λ හි වෘත්තාකාර DNA ප්‍රතිනිර්මාණය කරන විට, ආසන්න වශයෙන් 50 kb දිග පුනරාවර්තන කොටස් වලින් සමන්විත රේඛීය අණුවක් සෑදේ. මෙම සෑම කොටසක්ම ඇලෙන සුළු ලෙසින් වට වූ සම්පූර්ණ දිග ෆේජ් DNA වේ cos-sites - නියුක්ලියෝටයිඩ 12 කින් යුත් තනි කෙඳි 5"-"වලිග" ඒවා ඇලෙන සුළු ලෙස හැඳින්වේ ( cos) අවසන් වන්නේ ඒවා අන්‍යෝන්‍ය වශයෙන් අනුපූරක වන අතර සීමා කිරීම් කොටස්වල ඇලෙන සුළු කෙළවර මෙන් එකිනෙක යුගල කළ හැකි බැවිනි.
2. ෆේජ් හිස එවැනි එක් කොටසක් අඩංගු වේ, එවිට දැනටමත් එකලස් කර ඇති ක්රියාවලිය හිසට අනුයුක්ත කර ඇත.
සහල්. 23. බැක්ටීරියාභක්ෂක වර්ධනයේ ලයිටික් මාර්ගය λ
1 - සම්පූර්ණ දිග ෆේජ් DNA වල එක් කොටසක ෆේජ් හිස තුළට ඇසුරුම් කිරීම; 2 - සම්පූර්ණ ෆේජ් අංශුවක් එකලස් කිරීම.
Phage λ DNA හි ප්‍රමාණය ආසන්න වශයෙන් 50 kb වන අතර, එහි සැලකිය යුතු කොටසක් (20 kb පමණ) phage ප්‍රතිනිෂ්පාදනය සඳහා අත්‍යවශ්‍ය නොවන අතර එය ධාරක DNA වෙත ඒකාබද්ධ කිරීම සඳහා වගකිව යුතුය. මේ සම්බන්ධයෙන් ගත් කල, එය සමාන ප්‍රමාණයේ වෙනත් DNA කොටසකින් ප්‍රතිස්ථාපනය කළ හැකි බවට අදහසක් මතු විය. එහි ප්රතිඵලයක් ලෙස ප්රතිසංයෝජක අණුව සෛලය තුළ සංවර්ධනයේ ලයිටික් මාවතට “ආරම්භ වූ” “ප්රතිසංයෝජන” ෆේජ් එකක DNA ලෙස ප්‍රතිවර්තනය වේ. ප්රතිසංයෝජන අණු බැක්ටීරියෝෆේජ් λ හි ප්රධානීන් තුලට ඇසුරුම් කර ඇත in vitroසහ රිකිලි එකතු කිරීමෙන් පසුව, ආසාදිත ෆේජ් අංශු ලබා ගනී (රූපය 24).
සහල්. 24. සෛල තුළ DHA කොටස් ක්ලෝන කිරීම සඳහා phage λ-පාදක දෛශික භාවිතය ඊ. coli.
ෆේජ් λ DNA වල in vitro ඇසුරුම් සඳහා සාරය සකස් කිරීම වික්‍රියා දෙකක් භාවිතයෙන් සිදු කෙරේ. E.coli, ඒ සෑම එකක්ම phage λ හි නිශ්චිත විකෘති වික්‍රියාවකට එරෙහිව ලයිසොජනික් වේ (රූපය 25). එක් විකෘතියකට ප්‍රෝටීන් A (ෆේජ් ටර්මිනේස් පොලිපෙප්ටයිඩ වලින් එකක්) සංස්ලේෂණය කිරීමට නොහැකි වේ, අනෙක ප්‍රෝටීන් ඊ (ෆේජ් හෙඩ් ප්‍රෝටීන්) සංස්ලේෂණය කිරීමට නොහැකි වේ. මෙම ප්‍රෝටීන දෙකම phage λ DNA ඇසුරුම් කිරීම සඳහා අවශ්ය වේ. "A" සහ "E" සාරය මිශ්‍ර සහ concatemeric වේ (සම්පූර්ණ-දිග ෆේජ් DNA බහුඅවයවීකරණය කරන ලද කොටස් cos-sites) phage DNA, කැපීම සිදු වීමට පෙර අවසන් කිරීමට බන්ධනය වේ cos-sites, සහ phage heads තුලට ඇසුරුම් කර ඇත.
සහල්. 25. ඇසුරුම්කරණය in vitro Phage DNA λ
දිග 38 kb ට අඩු DNA අණුවක් ඇසුරුම් කිරීමේදී. ආසාදිත නොවන phage අංශුවක් ලබා ගන්නා අතර, 52 kbp ට වඩා දිගු කොටස්. හිසට නොගැලපේ. 50 kb දිග කොටස්. රේඛීය අණුවක, DNA cos අඩවි මගින් වෙන් කරනු ලබන අතර, මීළඟ කොටස හිස පුරවන විට අණුව කපා හරිනු ලබන්නේ මෙම අඩවිවල ය. කැපීම සිදු කරනු ලබන්නේ හිසට ඇතුල් වන ස්ථානයේ පිහිටි එන්සයිමයක් මගිනි.
ප්‍රතිග්‍රාහක සෛල තුළට විදේශීය ප්‍රවේණික තොරතුරු කාවැද්දූ කැබැල්ලක් සමඟ ප්රතිසංයෝජන ෆේජ් DNA හඳුන්වාදීමේ ක්රියාවලිය පදනම් වී ඇත්තේ ස්වාභාවික සංසිද්ධියක් මත ය - ෆේජ් DNA සම්ප්රේෂණය කිරීම.
සම්ප්රේෂණය(lat. සම්ප්රේෂණය- චලනය) යනු බැක්ටීරියාභක්ෂකයක් මගින් බැක්ටීරියා DNA එක් සෛලයකින් තවත් සෛලයකට මාරු කිරීමේ ක්‍රියාවලියයි. මේ අනුව, ෆේජ් DNA මත පදනම් වූ ප්රතිසංයෝජක DNA භාවිතයෙන් බැක්ටීරියා සෛල පරිවර්තනය කිරීම සඳහා ලබන්නාගේ සෛල හෝ විශේෂ උපකරණ විශේෂ සූදානමක් අවශ්ය නොවේ.
ප්රතිසංයෝජන ඩීඑන්ඒ සමඟ ෆේජ් අඩංගු සෛල සෙවීම සඳහා, අණුක දෙමුහුන් ක්රම සහ ප්‍රතිශක්තිකරණ පිරික්සීම භාවිතා කරනු ලැබේ, එය අපි ඊළඟ කොටසේදී සලකා බලමු.
Chang Lu යනු Virginia Tech හි රසායනික ඉංජිනේරු විද්‍යාව පිළිබඳ සහකාර මහාචාර්යවරයෙකි. (ඡායාරූපය: වර්ජිනියා ටෙක්)
සහකාර මහාචාර්ය, රසායන ඉංජිනේරු දෙපාර්තමේන්තුව, වර්ජිනියා තාක්ෂණ විශ්ව විද්යාලය ( වර්ජිනියා ටෙක්) ජානමය ද්රව්ය සෛල තුළට ලබා දීම “සැලකිය යුතු ලෙස වැඩිදියුණු කරන” ආකාරය Chang Lu සහ ඔහුගේ රසායන ඉංජිනේරුවන්ගේ පර්යේෂණ කණ්ඩායම සොයාගෙන ඇත. DNA. ඔවුන්ගේ වැඩ විස්තර කරන පත්‍රිකාවක් ප්‍රමුඛ ක්ෂුද්ර තරල සඟරාවක පළ විය. චිපයක් මත රසායනාගාරය, මෙන්ම තුළ ස්වභාවය .
වෛද්ය ලුගේ අවසාන ඉලක්කය වන්නේ පිළිකා ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්රතිකාර, ප්රතිකාර සඳහා ජානමය වශයෙන් වෙනස් කරන ලද සෛල නිර්මාණය කිරීම සඳහා ඔවුන් විසින් නිර්මාණය කරන ලද ක්රමය යෙදීමයි. ප්රාථමික සෛලසහ පටක පුනර්ජනනය.
සෛල තුළට ජාන ලබා දීම සඳහා බහුලව භාවිතා වන භෞතික ක්රමවලින් එකක් වන්නේ "ඇදහිය නොහැකි තරම් අකාර්යක්ෂම වන්නේ සම්පූර්ණ පටල මතුපිටින් කුඩා කොටසක් පමණක් පාරගම්ය වන බැවිනි", ආචාර්ය ලූ පැවසීය.
ලූ අනුගමනය කළ ක්රමය හැඳින්වේ විද්යුත් විච්ඡේදනය, සෛල වලට විද්යුත් ක්ෂේත්‍රයක් යෙදීමේ ප්රතිඵලයක් ලෙස සෛලවල පාරගම්යතාව වැඩි කිරීමේ දශක ගණනාවක් පැරණි සංසිද්ධිය අනුව නම් කර ඇති අතර එමඟින් ඒවායේ පටලයේ කුඩා සිදුරු ඇති වේ.
ආචාර්ය ලූ ඔහු සහ ඔහුගේ සගයන් විසින් පරිපූර්ණ කරන ලද විද්යුත් විච්ඡේදක ක්‍රමයේ ක්රියාකාරී යාන්ත්‍රණය පැහැදිලි කරයි: “සාම්ප්‍රදායික විද්යුත් විච්ඡේදක ක්රම මගින් DNA ලබා දෙන්නේ සෛල මතුපිට ඉතා සීමිත කොටසක් හරහා පමණි, එය විද්යුත් ක්ෂේත්‍රය සහ අතර අන්තර්ක්‍රියා පාලනය කරන භෞතික සංසිද්ධි මගින් තීරණය වේ. සෛලය. අපගේ ක්රමය මඟින් අපගේ දැනුමට අනුව ප්‍රථම වරට පෙන්නුම් කර ඇති සමස්ත සෛල පෘෂ්ඨය හරහා DNA ඒකාකාරව බෙදා හැරීමට ඉඩ සලසයි. එහි ප්‍රතිඵලය වන්නේ ජානමය ද්රව්ය හුවමාරුවෙහි විශාල වැඩිවීමකි.”
නව ප්රවේශය "දියර ගලායාම වක්‍ර නාලිකා හරහා ගමන් කරන විට පමණක් සිදුවන ජල ගතික බලපෑම් භාවිතා කරයි. එවැනි තත්වයන් යටතේ ප්රවාහය සුළි සෑදෙන බව දන්නා කරුණකි. එවැනි ප්‍රවාහයකින් ගෙන යන සෛල භ්‍රමණය වන අතර ඒවායේ මතුපිට ප්‍රමාණයෙන් වැඩි ප්‍රමාණයක් විද්යුත් ක්ෂේත්‍රයට නිරාවරණය වේ. වක්‍ර නාලිකා වල ප්‍රවාහ භාවිතා කරමින් ජාන බෙදා හැරීම ස්ථිතික විසඳුම් සහ සෘජු නාලිකා වල සම්ප්‍රදායිකව භාවිතා කරන විද්යුත් විච්ඡේදනයට වඩා සැලකිය යුතු වාසි ඇත.
"සර්පිලාකාර නාලිකාව සෘජු නාලිකාවකට සාපේක්ෂව දෙගුණයක වැඩිවීමක් ලබා දෙන අතර ස්ථිතික විසඳුමක් සමඟ සසඳන විට ඊටත් වඩා විශාල" යනුවෙන් විද්යාඥයා පැහැදිලි කරයි.
ප්‍රතිදීප්ත අන්වීක්ෂය භාවිතයෙන්, සෛල මතුපිට ඇති විද්යුත් විච්ඡේදක ප්‍රදේශ “සිතියම්” කිරීමට සහ එයට DNA ඇතුල් වීමේ ප්‍රමාණය තීරණය කිරීමට විද්යාඥයින්ට හැකි විය.
චිප් වෙබ් අඩවියක රසායනාගාරයෙන් ඡායාරූපයක්
ස්ථිතික සෛල අත්හිටුවීමක් සහිත cuvette ආකාරයේ උපාංග භාවිතයෙන් සම්ප්‍රදායික DNA බෙදාහැරීම සිදු වන්නේ සෛල මතුපිට පටු තීරුවක පමණි. සර්පිලාකාර හෝ වක්‍ර නාලිකාවක පාවෙන සෛල මත විද්යුත් විච්ඡේදනය සිදු කරන්නේ නම්, රූප සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් වේ, සෛලයේ මුළු මතුපිටම DNA හුවමාරුව ඒකාකාර ව්‍යාප්තියක් පෙන්නුම් කරයි.
සෛල තුළට ජාන සෘජුවම හඳුන්වාදීමේ ක්රම
සෛලයකට ජානයක් සෘජුව හඳුන්වාදීම ක්රම කිහිපයකින් සිදු කරයි:
මාරු කිරීම
ක්ෂුද්ර එන්නත් කිරීම
විද්යුත් විච්ඡේදනය
කුඩා සෛල ක්රමය
ලිපොසෝම වල ඇසුරුම් කිරීම
ඉලෙක්ට්රෝන තුවක්කුව
දී මාරුවීම් DNA කැල්සියම් පොස්පේට් ස්ඵටික මත අවශෝෂණය කර ඇත (Graham Van der Eb, 1973). කැල්සියම් අවක්ෂේප අංශු සෑදී ඇත. ඒවා ෆාගෝසයිටෝසිස් මගින් සෛලය මගින් ලබා ගනී.
පරිවර්තනයේ කාර්යක්ෂමතාව වැඩි කිරීම සඳහා, තෝරා ගැනීම සිදු කරනු ලබන ජානය අඩංගු විශේෂිත DNA වලට නිශ්චිත නොවන DNA වාහකයක් එකතු කරනු ලැබේ. සාමාන්‍යයෙන් DNA මේ සඳහා ගනු ලබන්නේ වසු තයිමස් හෝ සැමන් ශුක්‍රාණු වලිනි. DNA වලින් සමහරක් පටලයට බැඳෙන අතර සෛල තුළට ඇතුල් නොවේ. DNA සෛල වලින් 15 සිට 90% දක්වා පිළිගනු ලැබේ. පරිපාලනයෙන් දින කිහිපයකට පසු, සෛල කුඩා ප්‍රමාණයකට විදේශීය ජාන ප්‍රකාශ කිරීමට හැකි වේ, නමුත් පසුව ප්‍රකාශන මට්ටම පහත වැටෙන අතර 10 -3 - 10 -5 සෛල වැඩි හෝ අඩු ස්ථායී පරිවර්තනයකට භාජනය වේ.
DEAE-dextran, DNA අවශෝෂණය කරන බහුඅවයවයක්, මාරු කිරීම සඳහා ද භාවිතා වේ. සෛල ඇතුල් වීමේ බලපෑම සහ ප්‍රකාශන කාලය ඉහළයි, නමුත් ස්ථායී පරිවර්තන සංඛ්යාතය කැල්සියම් අවක්ෂේප භාවිතා කරන විට වඩා අඩුය. ග්ලිසරෝල් කම්පනය (HEPES බෆරයේ 15% ග්ලිසරෝල් ද්‍රාවණයක මිනිත්තු 4) මගින් මාරු වීමේ වාර ගණන වැඩි වේ.
ඕනෑම ජානයක් කලින් ක්ලෝන කරන ලද තෝරාගත හැකි සලකුණක් සමඟ බන්ධනය කර ඇත්නම් එය සෛල තුළට හඳුන්වා දිය හැකිය. කෙසේ වෙතත්, වැඩිදුර අධ්‍යයනයන් පෙන්නුම් කළේ සෛලයෙන් පිටත බැඳීම අවශ්ය නොවන බවයි. තෝරාගත් ජානයක් අවශෝෂණය කරන සෛල කැල්සියම් අවක්ෂේපයේ ඇති අනෙකුත් DNA අවශෝෂණය කරයි. මේ අනුව, ක්රමය භාවිතා කිරීම cotransformations, කැල්සියම් අවක්ෂේපයක් සෑදීම සඳහා මෙම DNA මිශ්‍රණයට තෝරාගත හැකි සලකුණක් සමඟ ඇතුළත් කළහොත් ඕනෑම ක්ලෝන කරන ලද DNA කොටසක් පාහේ සංස්කෘතික යුකැරියෝටික් සෛල තුළට හඳුන්වා දිය හැක.
මාරු කිරීම සඳහා වර්ණදේහ හෝ වර්ණදේහ කොටස් භාවිතා කළ හැක. මයිටොසිස් අවධියේදී පරිත්යාගශීලී සෛල අවහිර වී ඇත. ඔස්මොටික් කම්පන සහ සමජාතීයකරණයේ බලපෑම යටතේ මයිටොටික් වර්ණදේහ නිකුත් වේ. අවකල කේන්ද්‍රාපසාරී මගින් ඒවා පවිත්‍ර කරනු ලැබේ. වර්ණදේහ කැල්සියම් ක්ලෝරයිඩ් සමඟ සෛල මතුපිට තැන්පත් කර ඇති අතර පැය කිහිපයකට පසු ඒවා පටල සිදුරු කළ හැකි ප්‍රතික්‍රියාකාරකයක් සමඟ ප්රතිකාර කරනු ලැබේ (නිදසුනක් ලෙස, ග්ලිසරෝල්).
ග්‍රාහක සෛල සැකසීම සඳහා, වර්ණදේහ අවම වශයෙන් විනාශ වන බැවින්, රළු ලෙස පිරිසිදු කරන ලද වර්ණදේහ සූදානම භාවිතා කරනු ලැබේ. සෛල 1 ක් සැකසීමට වර්ණදේහ ගණන සීමා වේ. ප්‍රතිග්‍රාහක සෛල 1කට වර්ණදේහ 20 කට වඩා භාවිතා නොකිරීම වඩා හොඳය, මන්දයත් අත්හිටුවීමේදී වර්ණදේහවල ඉහළ සාන්ද්‍රණයකදී ඒවා එකතු වේ. ප්‍රතිග්‍රාහක සෛලය ජෙනෝමයට ඒකාබද්ධ කළ හැකි සහ ස්වාධීනව ප්‍රතිවර්තනය කළ හැකි පරිත්යාගශීලී වර්ණදේහවල කොටස් අඩංගු වේ. හඳුන්වා දුන් කොටස්වල මකාදැමීම් බොහෝ විට නිරීක්ෂණය වේ.
සෑම සෛලයකටම ඉහළ සංඛ්‍යාතවලදී ජානමය DNA පරිවර්තනය කිරීමේ හැකියාවක් නොමැත. මානව ෆයිබ්‍රොබ්ලාස්ට් ප්ලාස්මිඩ් DNA කාර්යක්ෂමව ඇතුළත් කරන අතර ප්‍රවේණික DNA යන්තම් ඇතුළත් කරයි.
DNA ක්ෂුද්ර එන්නත් කිරීමක්ෂීරපායී සෛල තුළට මයික්‍රෝන 0.1-0.5 ක විෂ්කම්භයක් සහිත මයික්‍රොපිපෙට් නිෂ්පාදනය සඳහා උපකරණයක් සහ ක්ෂුද්ර උපාමාරකයක් (රූපය 45) පැමිණීමත් සමඟ හැකි විය. මේ අනුව, thymidine kinase (TK) ජානය සහ ප්ලාස්මිඩ් pBR322 සමඟ හර්පීස් වෛරසයේ කොටසක් අඩංගු ප්ලාස්මිඩ් TK - සෛල තුළට එන්නත් කරන ලද අතර TK - ජානය න්‍යෂ්ටීන් තුළට විනිවිද ගොස් සාමාන්‍යයෙන් ඒවා තුළ ප්‍රතිවර්තනය වන බව පෙන්නුම් කරන ලදී. ක්ෂුද්ර එන්නත් භාවිතයෙන් DNA හඳුන්වාදීමේ ක්රමය 70 ගණන්වල මුල් භාගයේදී ඇන්ඩර්සන් සහ ඩයකෝමාකෝස් විසින් වර්ධනය කරන ලදී. ප්‍රතිපත්තිමය වශයෙන්, හොඳ උපකරණ සමඟ, පැය 1 කින් සෛල 500-1000 ක් එන්නත් කළ හැකි අතර, හොඳම අත්හදා බැලීම් වලදී, සෛල වලින් 50% ක් තුළ එන්නත් කරන ලද ජානවල ස්ථායී ඒකාබද්ධතාවය සහ ප්රකාශනය නිරීක්ෂණය කෙරේ. විස්තර කරන ලද ක්‍රමයේ වාසිය වන්නේ ඕනෑම සෛලයකට ඕනෑම DNA හඳුන්වා දීමට එය ඔබට ඉඩ සලසන අතර සෛල තුළ හඳුන්වා දුන් ජානය පවත්වා ගැනීම සඳහා තෝරා ගැනීමේ පීඩනය අවශ්ය නොවේ.
සහල්. 45. ක්ෂුද්ර එන්නත් මගින් DNA හඳුන්වාදීම
විද්යුත් විච්ඡේදනයඅධි වෝල්ටීයතා ස්පන්දන ප්‍රතිලෝමව ජෛව පටලවල පාරගම්යතාව වැඩි කරයි යන කාරණය මත පදනම් වේ. සෛල තුළට හඳුන්වා දිය යුතු සෛල සහ DNA කොටස් විද්යුත් විච්ඡේදක මාධ්යයට එකතු කරනු ලැබේ (රූපය 46). අධි-වෝල්ටීයතා ස්පන්දන (වෝල්ටීයතා 200 - 350 V, ස්පන්දන කාලසීමාව 54 ms) මාධ්‍යය හරහා ගමන් කරන අතර, සයිටොප්ලාස්මික් පටලයේ සිදුරු (විද්යුත් බිඳවැටීම) සෑදීමට තුඩු දෙයි, DNA වැනි සාර්ව අණු සඳහා ප්‍රමාණවත් ආයු කාලය සහ ප්‍රමාණය ඔස්මොටික් බලවේගවල ක්රියාකාරිත්වයේ ප්රතිඵලයක් ලෙස බාහිර පරිසරයෙන් සෛලයට ඇතුල් වීමට. ඒ සමගම, සෛල පරිමාව වැඩි වේ.
එහි ක්‍රියාකාරීත්වයේ විද්යුත් ක්ෂේත්‍ර ශක්තිය සහ කාලසීමාව, DNA පරිවර්තනය කිරීමේ සාන්ද්‍රණය සහ එක් එක් සෛල පද්ධතිය සඳහා ප්‍රතිග්‍රාහක සෛල පර්යේෂණාත්මකව තෝරා ගනු ලබන්නේ ජීවී සෛල මගින් DNA අවශෝෂණයේ ඉහළ ප්‍රතිශතයක් ලබා ගැනීම සඳහා ය. ප්‍රශස්ත විද්යුත් විච්ඡේදක තත්ත්‍වයන් යටතේ පරිවර්තක සංඛ්‍යාව ඉතිරිව ඇති සෛල වලින් 80% දක්වා ළඟා විය හැකි බව පෙන්වා දී ඇත.
විද්යුත් විච්ඡේදනය ජෛව රසායනික ක්‍රමයකට වඩා භෞතික ක්‍රමයක් වන අතර එය බහුලව භාවිතා වන්නේ එබැවිනි. සංස්කෘත සත්ව සෛල, ප්‍රොටෝසෝවා, යීස්ට්, බැක්ටීරියා සහ ශාක ප්‍රොටොප්ලාස්ට් වැනි විවිධ වර්ගයේ සෛල තුළට DNA අණු හඳුන්වා දීම සඳහා විද්යුත් විච්ඡේදනය සාර්ථකව භාවිතා කළ හැකි බව බොහෝ අධ්‍යයනයන් මගින් පෙන්නුම් කර ඇත. ද්වි-ස්ථර ලිපිඩ පටලයක් මත අධි වෝල්ටීයතා විසර්ජනයක විද්යුත් විච්ඡේදක බලපෑම එහි වක්‍ර අරය මත රඳා පවතින බව පෙනේ. එමනිසා, කුඩා බැක්ටීරියා සෛල 1-2 kV/cm ක්ෂේත්‍ර ශක්තියකින් DNA ඵලදායි ලෙස අවශෝෂණය කරන විශාල සත්ව හා ශාක සෛලවලට වඩා ඉතා ඉහළ ක්ෂේත්‍ර ශක්තියකින් (10 kV/cm හෝ ඊට වැඩි) DNA අවශෝෂණය කරයි.
විද්යුත් විච්ඡේදනය යනු DNA අණු සෛල තුළට හඳුන්වා දීමේ සරලම, වඩාත් ඵලදායී සහ ප්‍රතිනිෂ්පාදනය කළ හැකි ක්‍රමයයි. කෙසේ වෙතත්, මෑතක් වන තුරු, අනුක්රමික උපාංග නොමැතිකම හේතුවෙන් සීමිත රසායනාගාර සංඛ්යාවක මෙම ක්රමය භාවිතා කරන ලදී - ඉලෙක්ට්රෝපරේටර්. ඉදිරි වසරවලදී එවැනි උපකරණ මතුවීම සහ වැඩිදියුණු කිරීම විවිධාකාර සෛල වර්ගවල ජාන ඉංජිනේරු විද්යාවෙහි මෙම ප්රවේශය පුළුල් ලෙස භාවිතා කිරීමට හේතු වනු ඇත.
සහල්. 46. විද්යුත් විකාශන ක්රමය
"කුඩා සෛල" colcemid සමඟ mitosis හි පරිත්යාගශීලී සෛල අවහිර කිරීමෙන් ලබා ගනී. colcemid සමඟ සෛල දිගුකාලීනව ප්රතිකාර කිරීමත් සමග, එක් එක් වර්ණදේහ වටා නව න්යෂ්ටික පටලයක් සෑදී ඇත. සයිටොචලසින් බී සහ කේන්ද්‍රාපසාරී සමඟ ප්රතිකාර කිරීම සයිටොප්ලාස්මික් පටලයේ ආවරණය කර ඇති ක්ෂුද්ර න්‍යෂ්ටීන් නියෝජනය කරන කුඩා සෛල සෑදීමට හේතු වේ.
එහි ප්රතිඵලයක් වශයෙන් කුඩා සෛල විවිධ ආකාරයේ බලපෑම් වලට ඉතා සංවේදී වේ, එබැවින් විලයනය සඳහා විශේෂ මෘදු තත්වයන් තෝරා ගනු ලැබේ. ක්රමය දුෂ්කර, චපල, අඩු කාර්යක්ෂමතාව - 10 -6 - 10 -7.
ලිපොසෝම වල ඇසුරුම් කිරීමසීමා කිරීමේ එන්සයිමවල විනාශකාරී ක්‍රියාවෙන් බාහිර ජානමය ද්රව්ය ආරක්ෂා කිරීමට භාවිතා කරයි.
Liposomes යනු ෆොස්ෆොලිපිඩ් වලින් සමන්විත ගෝලාකාර කවච වේ. ඒවා ලබා ගන්නේ ජලීය ද්‍රාවණයක් සහ ලිපිඩ මිශ්‍රණයක් තියුනු ලෙස සොලවා ගැනීමෙන් හෝ අල්ට්‍රා සවුන්ඩ් සමඟ පොස්ෆොලිපිඩ් වල ජලීය ඉමල්ෂන් වලට ප්රතිකාර කිරීමෙන් ය. ෆොස්ෆැටයිඩයිල්සෙරීන් සහ කොලෙස්ටරෝල් වලින් සමන්විත Liposomes සත්ව හා ශාක සෛල වලට DNA හඳුන්වා දීම සඳහා වඩාත් සුදුසු වේ. Liposome හුවමාරු පද්ධති සෛල වලට අඩු විෂ සහිත වේ.
ජීව විද්‍යාත්මක බැලස්ටික් ක්රමය (ජීව විද්‍යාව)වර්තමානයේ ශාක පරිවර්තනය කිරීම සඳහා වඩාත් ඵලදායී ක්රමවලින් එකකි, විශේෂයෙන්ම මොනොකොට්.
ක්‍රමයේ සාරය නම් පරිවර්තනය සඳහා අවශ්ය ජාන සැකැස්ම අඩංගු දෛශික DNA මයික්‍රෝන 0.6-1.2 විෂ්කම්භයක් සහිත කුඩා ටංස්ටන් අංශු මතට ඉසීමයි. DNA රැගෙන යන ටංස්ටන් අංශු සෙලෝපේන් උපස්ථරයකට යොදන අතර ජීව විද්‍යාත්මක තුවක්කුවක් තුළ තබා ඇත. කැලස් හෝ සෛල අත්හිටුවීම agar මාධ්යයක් සහිත පෙට්‍රි පිඟානකට යොදන අතර රික්තක පොම්පයක් භාවිතයෙන් තුවක්කුවේ පීඩනය 0.1 atm දක්වා අඩු වේ. පීඩනය මුදා හරින මොහොතේ, ජෛව තුවක්කුවෙන් ටංස්ටන් අංශු දැවැන්ත වේගයකින් පිටවන අතර, සෛල බිත්ති ඉරා, සෛලවල සෛල ප්ලාස්මයට සහ න්යෂ්ටියට ඇතුල් වේ.
සාමාන්‍යයෙන්, ටංස්ටන් අංශුවල විශාල සංඛ්‍යාව සහ පීඩනය හේතුවෙන් කෙලින්ම මධ්‍යයේ පිහිටා ඇති සෛල මිය යන අතර වඩාත් සාර්ථකව පරිවර්තනය වූ සෛල මධ්‍යයේ සිට 0.6-1 සෙ.මී. ඊළඟට, සෛල තවදුරටත් වගා කිරීම සහ ප්රතිජනනය සඳහා මාධ්යයට ප්රවේශමෙන් මාරු කරනු ලැබේ.
ජීව විද්‍යාත්මක තුවක්කුවක් භාවිතා කරමින්, බඩ ඉරිඟු, සහල්, තිරිඟු සහ බාර්ලි වැනි ඒකකොටිලඩෝනස් ශාක පරිවර්තනය කරන ලදී. මෙම අවස්ථාවේ දී, ස්ථාවර පරිවර්තන පැල ලබා ගන්නා ලදී. සංක්‍රාන්ති මොනොකොට් ලබා ගැනීමේ සාර්ථකත්වයට අමතරව, ඩීඑන්ඒ සෘජුවම කළල පරාග බවට මාරු කිරීම සහ අභිජනන කාර්යයේ වැදගත් පියවරක් වන ට්‍රාන්ස්ජනික් ඩයිහැප්ලොයිඩ් ශාක වේගයෙන් නිෂ්පාදනය කිරීම සඳහා ජෛව පරිවර්තනය භාවිතා වේ. වර්තමානයේ, දුම්කොළ පැලවල පරිවර්තනය මෙම ක්රමය භාවිතා කර සිදු කර ඇති අතර, හැප්ලොයිඩ් ශාක ප්රතිජනනය කිරීමෙන් පසු ස්ථායී පරිවර්තක ලබාගෙන ඇත.