Препараты антител. Моноклональные антитела: обзор препаратов, применение для лечения Препараты содержащие специфические антитела называются
Иммунобиологические препараты
для диагностики, профилактики и
лечения инфекционных заболеваний
Юрова В.А., Бутакова Л.Ю., Крафт Л.А., Куклина Н.В., Сазанская А.А., Карабасова Е.Б., Винникова Ю.В., Илинская Б.В., Прокопьев В.В.
Подписано в печать Бумага офсетная. Тираж: 500 экз.
Отпечатано в типографии: :;
ГОУ ВПО Алтайский государственный медицинский университет Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию.
Иммунобиологические препараты
для диагностики, профилактики и
лечения инфекционных заболеваний
Учебное пособие для самостоятельной подготовки студентов к практическим занятиям по микробиологии
Барнаул, 2011
Рецензенты:
В учебном пособии изложены теоретические вопросы, касающиеся природы и использования иммунобиологических препаратов - диагностических и лечебно-профилактических: вакцин, сывороток, бактериофагов и др.
Студенты факультетов лечебного профиля (лечебного, педиатрического, стоматологического) нуждаются в более глубоком изучении механизмов действия бактериологических препаратов, ответной реакции организма на введение вакцинных и сывороточных препаратов, осложнений, возникающих при использовании некоторых препаратов.
Иммунобиологические препараты для диагностики, профилактики и лечения инфекционных заболеваний: Юрова В.А., Бутакова Л.Ю., Крафт Л .А., Куклина Н.В., Сазанская А.А., Карабасова Е.Б., Винникова Ю.В., Илинская Б.В.. - Барнаул, 2002. - 46 с.
(с) Алтайский государственный медицинский университет, 2002
© Юрова В.А., Бутакова Л. Ю., КрафтЛ.А., Куклина Н.В., Сазанская
А.А., Карабасова Е.Б., Винникова Ю.В., Илинская Б.В., 2002
В профилактике, диагностике, лечении инфекционных заболеваний широко используются иммунобиологические препараты, изготавливаемые из живых и убитых микроорганизмов (бактерий, риккетсий, вирусов), продуктов их жизнедеятельности (токсинов), а также отдельных антигенов микробной клетки, извлеченных различными методами. Также для лечебных и диагностических целей используются сыворотки и специфические гамма-глобулины и иммуноглобулины. Кроме того, широко используются в диагностических и лечебных целях препараты бактериофагов.
Сведения о составе, получении, механизме действия иммунобиологических препаратов необходимы врачу в его практической деятельности. Вместе с тем, возможность ознакомления с вновь созданными вакцинными и сывороточными препаратами, особенностями их применения у практических врачей есть не всегда. Кроме того, в современных учебниках не полностью отражены вопросы, касающиеся получения, механизма действия и использования иммунобиологических препаратов.
Все вышесказанное привело к необходимости создания учебного пособия, содержащего сведения об иммунобиологических препаратах. Данное пособие включает информацию о получении, активном начале, применении иммунобиологических препаратов, об осложнениях, возникающих при использовании некоторых из них. Пособие предназначено для подготовки студентов третьего курса лечебного, педиатрического, стоматологического и медико-профилактического факультетов к практическим занятиям по частной микробиологии.
Классификация иммунобиологических препаратов
I.Диагностические препараты.
Препараты, содержащие антигены - диагностикумы, аллергены,токсины.
Препараты, содержащие антитела - диагностические сыворотки.
Диагностические бактериофаги.
II.Лечебно-профилактические препараты.
Препараты, содержащие антигены - вакцины.
Препараты, содержащие антитела - лечебные сыворотки и гамма-глобулины и иммуноглобулины.
Бактериофаги.
Микробы-антагонисты.
Интерфероны и другие цитокины.
Раздел I
Диагностические препараты
Диагностические препараты используются при лабораторной диагностике ряда заболеваний, точный диагноз которых может быть поставлен только при помощи бактериологических и вирусологических исследований. Кроме того, диагностические препараты необходимы при подтверждении лабораторными методами диагноза заболевания, имеющего атипичное течение, либо заболевания, характеризующегося полиморфизмом симптомов. Помимо этого, диагноз заболеваний, не встречающихся на данной территории и в данное время, должен быть обязательно подтвержден лабораторными методами.
В диагностике инфекционных заболеваний широко применяются микробиологические приемы диагностирования. При этом используются бактериологический, вирусологический, серологический, аллергический,иммунологические методы диагностики, а также методы молекулярной гибридизации и ПЦР. Для каждого из этих методов необходимы определенные диагностические иммунобиологические препараты: диагностикумы, диагностические сыворотки (видовые, типовые, комплексные, адсорбированные и др.), комплемент, аллергены, бактериофаги, системы для проведения РИФ и ИФА, зонды нуклеиновых кислот.
Классификация диагностических препаратов
1.Препараты, содержащие антитела - диагностические сыворотки:
агглютинирующие;
преципитирующие;
антитоксические;
гемолитические;
противовирусные;
люминесцирующие;
антиглобулиновые.
2.Препараты, содержащие антигены:
2.1) диагностикумы:
2.1.1.бактериальные;
2.1.2.эритроцитарные;
2.1.3.вирусные;
2.2.)токсины;
2.3.)аллергены.
3. Диагностические бактериофаги.
1. Диагностические сыворотки
В диагностике инфекционных заболеваний широко используются иммунные реакции для идентификации микроорганизмов (бактерий и вирусов) или токсинов. Для постановки таких реакций необходимы специфические диагностические сыворотки.
1.1. Агглютинирующие сыворотки.
Агглютинирующие сыворотки получают путем иммунизации кроликов взвесью убитых микроорганизмов или их антигенов с последующим взятием у них крови и приготовлением сыворотки. Агглютинирующие сыворотки применяют для идентификации микроорганизмов в реакции агглютинации. Недостатком таких сывороток является то, что они способны давать групповые реакции агглютинации, т.к. они содержат антитела к бактериям, имеющим общие антигены. Поэтому, в настоящее время большинство сывороток используется адсорбированными, Адсорбированные сыворотки содержат только типовые или видовые антитела, соответствующие определенному типу или виду антигена. Для получения таких сывороток применяют метод Кастеллани - метод адсорбции. Этот метод заключается в истощении сыворотки на групповые агглютинины путем насыщения ее родственными гетерогенными бактериями. При этом происходит адсорбция групповых антител, а специфические антитела остаются в сыворотке. Таким путем можно получить монорецепторные сыворотки - сыворотки, содержащие антитела только к одному антигену, и поливалентные сыворотки, дающие реакции агглютинации с двумя-тремя родственными бактериями, имеющими общий антиген. Титром агглютинирующей сыворотки называется то ее наибольшее разведение, при котором идет реакция агглютинации.
Агглютинирующие сыворотки широко применяют, например, при диагностике заболеваний, вызываемых эшерихиями, сальмонеллами и другими представителями семейства энтеробактерий.
1.2. Преципитирующие сыворотки.
Преципитирующие сыворотки получают иммунизацией кроликов антигенами бактерий, их экстрактами и токсинами. Титром преципитирующей сыворотки называется то максимальное разведение антигена, при котором идет реакция преципитации. Преципитирующие сыворотки выпускаются с высоким титром - не менее 1:100000. Это связано с тем, что антиген, определяемый в реакции преципитации, имеет мелкодисперсную структуру и в единице объема его может содержаться больше, чем в таком же объеме сыворотки - антител.
Специфические преципитирующие сыворотки применяются при диагностике инфекционных заболеваний (сибирская язва, чума, туляремия, дифтерия, и др.), в судебно-медицинской экспертизе для определения видовой принадлежности белка, в санитарной практике для обнаружения соответствия белковых веществ в продуктах (при подозрении на фальсификацию).
Реакция преципитации может быть поставлена в виде кольцепреци-питации или реакции преципитации в геле.
1.3.Гемолитические сыворотки.
Гемолитические сыворотки получают путем иммунизации кроликоввзвесью эритроцитов барана. Титром сыворотки называют то ее максимальное разведение, которое в присутствии комплемента вызывает гемолиз 3% взвеси эритроцитов барана. Гемолитические сыворотки используют для титрования комплемента и при постановке реакции связывания комплемента в индикаторной системе.
1.4.Противовирусные сыворотки.
Иммунные противовирусные сыворотки получают путем иммунизации различных животных в зависимости от вида вируса. Например, сыворотку против аденовирусов получают иммунизацией кроликов, сыворотку против вируса гриппа - иммунизацией белых хорьков и т.д.
Диагностические противовирусные сыворотки используются для определения вида или типа вируса в РТГА, РСК., РН.
1.5.Люминесцирующие сыворотки. Люминесцирующие сыворотки представляют собой иммунные сыворотки, содержащие специфические антитела, меченые флюоресцирующими красителями. При приготовлении люминесцирующих сыворотокпроводят присоединение к глобулиновой фракции иммунной сывороткиразличных флюорохромов путем прочной химической связи. Люминесцирующие сыворотки используют при постановке РИФ.
1.6. Анпшглобулиновые сыворотки.
Антиглобулиновые сыворотки (АГС) содержат антитела к иммуноглобулинам сыворотки человека или кролика - в зависимости оттого, какая иммунная сыворотка используется в реакции. АГС получают путем иммунизации животных иммуноглобулинами человека или кролика. Такие сыворотки используют для постановки непрямой РИФ, реакции ИФА, реакции Кумбса.
Патогенез .
а. Образование иммунных комплексов. Иммунные комплексы, состоящие из лекарственного средства и антитела, неспецифически связываются с мембранами эритроцитов с последующей активацией комплемента. Прямая проба Кумбса с антителами к комплементу обычно положительна, а с антителами к IgG — отрицательна. Антитела к препарату можно обнаружить с помощью инкубации сыворотки больного с нормальными эритроцитами в присутствии комплемента и данного препарата. Большинство случаев лекарственной иммунной гемолитической анемии обусловлены именно этим механизмом. Повторное назначение препарата даже в небольшой дозе вызывает острый внутрисосудистый гемолиз, проявляющийся гемоглобинемией, гемоглобинурией и ОПН .
б. Образование цитотоксических антител. При связывании с эритроцитами препарат становится иммуногенным и стимулирует образование антител, обычно IgG . Положительна лишь прямая проба Кумбса с антителами к иммуноглобулинам. Антитела к препарату определяют следующим образом. После инкубации нормальных эритроцитов с этим препаратом их смешивают с сывороткой больного. При наличии антител к препарату развивается гемолиз. Классическим примером иммунной гемолитической анемии, вызванной цитотоксическими антителами, служит анемия при применении бензилпенициллина. Она возникает редко и только при назначении препарата в высоких дозах (более 10 млн ед/сут в/в ): прямая проба Кумбса с антителами к иммуноглобулинам положительна примерно у 3% больных, гемолиз развивается еще реже. Бензилпенициллин вызывает внесосудистый гемолиз. Появление IgG к бензилпенициллину не связано с аллергией к пенициллинам, обусловленной IgE .
в. Некоторые лекарственные средства, например цефалоспорины, вызывают агрегацию неспецифических IgG и комплемента, хотя это редко сопровождается гемолитической анемией. Прямая проба Кумбса может быть положительной, непрямая проба Кумбса всегда отрицательна.
г. Образование аутоантител. Лекарственные средства могут стимулировать образование аутоантител к антигенам системы Rh . Вероятно, это происходит за счет угнетения активности T-супрессоров и пролиферации клонов B-лимфоцитов, продуцирующих соответствующие антитела. Прямая проба Кумбса с антителами к иммуноглобулинам положительна. Инкубация сыворотки больного с нормальными эритроцитами в отсутствие лекарственного средства приводит к абсорбции IgG на эритроцитах. Синтез аутоантител к эритроцитам вызывают метилдофа, леводофа и мефенамовая кислота. Прямая проба Кумбса положительна примерно у 15% больных, принимающих метилдофу, однако гемолитическая анемия развивается менее чем у 1% больных. Влияние метилдофы на образование аутоантител к эритроцитам, по-видимому, дозозависимо. Анемия развивается постепенно, в течение нескольких месяцев применения препарата, и обусловлена внесосудистым гемолизом.
2. Лечение. Первый и наиболее важный этап лечения лекарственной иммунной гемолитической анемии — отмена препарата, вызвавшего ее. При гемолизе, вызванном иммунными комплексами, после этого быстро наступает выздоровление. В тяжелых случаях наблюдается ОПН . При гемолизе, вызванном аутоантителами, выздоровление более медленное (обычно несколько недель). Проба Кумбса может оставаться положительной в течение 1—2 лет.
Статья на конкурс «био/мол/текст»: Одну из самых существенных опасностей для здоровья человека представляют бактерии. Но и у бактерий есть противники: вирусы-бактериофаги, которые используют микробную клетку в качестве гостиницы, где всё включено, а покидая пристанище, нередко убивают хозяина. Изобретение метода фагового дисплея позволило использовать свойства бактериофагов в поиске новых антител, которые чрезвычайно востребованы для совершенствования диагностики и терапии многих опасных заболеваний.
Обратите внимание!
Спонсором номинации «Лучшая статья о механизмах старения и долголетия» является фонд «Наука за продление жизни ». Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма Helicon .
Спонсоры конкурса: Лаборатория биотехнологических исследований 3D Bioprinting Solutions и Студия научной графики, анимации и моделирования Visual Science .
Антитела как лекарства
В фармакологии используются два основных понятия: лекарство и мишень . Мишень - это структура организма, связанная с определенной функцией, нарушение которой приводит к заболеванию. В случае болезни на мишень можно оказать определенное воздействие, которое должно привести к лечебному эффекту. Лекарством называется вещество, специфически взаимодействующее с мишенью и влияющее на состояние клетки, ткани, организма . В качестве мишени может выступать рецептор на поверхности клеточной мембраны, фермент или канал, проводящий в клетку различные соединения. Однако путь к потребителю для любого лекарства долог: после подтверждения его функциональной активности следуют стадии доклинических и клинических испытаний, на которых малые молекулы подстерегает опасность так никогда и не стать лекарством. Под действием ферментных систем пациента они могут стать ядовитыми, или их изомеры окажутся токсичными. Низкомолекулярное вещество может выводиться слишком быстро или, напротив, накапливаться в организме, отравляя его. Поэтому в последние годы всё бóльшую долю на рынке лекарственных средств занимают макромолекулы, и среди них важнейшую роль играют антитела - защитные белки организма (рис. 1).
Рисунок 1. Структура антитела. Антитело состоит из двух тяжелых (HC) и двух легких (LC) аминокислотных цепей, соединенных между собой. Каждая из этих цепей имеет вариабельный домен (V H или V L) , который ответственен за связывание антигена. Вариа бельным он называется именно потому, что эти участки наиболее сильно отличаются у разных антител, то есть представлены множеством вариа нтов. Участок, который отщепляется ферментом папаином , называется Fab-фрагментом.
Когда в кровь попадает антиген - компонент бактерии или вируса, - он моментально оказывается под пристальным вниманием двух основных типов иммунных клеток: Т- и В-лимфоцитов . В-клетки после стимуляции со стороны Т-клеток или при непосредственном контакте с чужеродным агентом синтезируют антитела к нему. Некоторые из активированных В-лимфоцитов - плазматические клетки - специализируются на продукции антител, а остальные становятся клетками памяти , чтобы при встрече с тем же антигеном в будущем дать ему быстрый и эффективный отпор. Синтезированное плазматической клеткой антитело связывается с «чужаком», тем самым обезвреживая его. Происходит это несколькими путями: антитела специфически связываются с токсичными участками антигена, агглютинируют (слипаются) с крупными частицами, которые несут антигены на своей поверхности, или даже напрямую вызывают разрушение бактериальной клетки. Кроме того, «облепленный» антителами антиген становится уязвимым для других компонентов иммунитета - например, для макрофагов или системы комплемента .
От структуры антитéла зависят такие важные свойства, как связывание им антигена, прочность этого связывания и стабильность молекулы. Однако природа создания антител в организме очень сложна, и никто не может гарантировать, что в ответ даже на идентичные антигены образуются одинаковые по структуре антитела. Если же для создания лекарства или диагностического набора используются антитела к одному и тому же антигену, но обладающие разной структурой, то из-за разницы в стабильности и специфичности о стандартизации и воспроизводимости результатов работы можно будет забыть. Это означает, что такие антитела никак не могут стать диагностическими или лекарственными. Отсюда вывод: нужны антитела с идентичной структурой .
Антитела-«клоны» получают при помощи методов клеточной биологии из одной клетки-предшественницы. Такие антитела называются моноклональными . Их использование в качестве терапевтических агентов стало для медицины стратегическим этапом в смене концепции лечения - от неспецифической терапии к направленной. На сегодняшний день моноклональные антитела наиболее активно используются в онкогематологии, лечении опухолей, аутоиммунных заболеваний, а особенно широко - в диагностике .
Получение антител для нужд человека, как правило, начинается с иммунизации животных. Проводится несколько инъекций антигена, и в сыворотке крови накапливаются специфические антитела. Эти антитела, полученные напрямую из сыворотки иммунизированного животного, произведены разными плазматическими клетками, то есть они поликлональны . Для получения совершенно идентичных - моноклональных - антител в семидесятых годах прошлого века учеными Георгом Кёлером и Сéсаром Мильштейном был разработан метод гибридóм . Он основан на слиянии плазматических лимфоцитов (продуцируют антитела, но не живут в культуре) и клеток миеломы (это опухолевые клетки, которые ничего не продуцируют, но зато замечательно культивируются), в результате чего такая гибридная клетка от В-лимфоцита наследует способность выделять нужные исследователям антитела, а от опухолевой - бессмертие (практически бесконечное деление).
Гибридома стала выдающимся достижением, открывшим огромные возможности для исследователей . Однако антитела, которые можно получить с помощью гибридомного метода, всё же нарабатываются животными и не годятся для терапии человека. Поэтому перед исследователями встала задача получения полностью человеческих антител. Для ее решения была разработана группа методов, названная дисплейной . Общим для всех этих методов является то, что они предполагают работу со «сцепкой» нуклеотидной и аминокислотной последовательностей каждого конкретного варианта антитела. Название «дисплейные» происходит от английского display - выставлять напоказ, демонстрировать. Неотъемлемой стадией этих методов является «выставление» на поверхности фаговой частицы фрагментов антител для дальнейшего отбора нужных вариантов антигенами.
Библиотека в пробирке
Метод, который был назван фаговым дисплеем , основан на способности бактериофагов (вирусов, поражающих бактерии) выставлять на своей поверхности случайные пептидные последовательности в составе поверхностных белков . Бактериофаг представляет собой ДНК, окруженную белковой оболочкой - капсидом, - и способен размножаться только внутри клетки-хозяина. Проникая туда, он беззастенчиво пользуется ферментными системами несчастной бактерии, предоставляя ей свою ДНК для синтеза необходимых для его размножения белков . Инфицированная фагом бактериальная клетка послушно воспроизводит всё, что закодировано в геноме вируса, чтобы его потомство собрало свою оболочку из готовых строительных блоков. Если в геном фага-прародителя исследователем внедрена нуклеотидная последовательность, кодирующая нужный пептид, у его потомства на поверхности вирусной частицы появляется несколько копий гибридного капсидного белка, состоящего из собственной полипептидной цепи и фрагмента антитела. Множество бактериофагов, на поверхности которых представлены случайные фрагменты антител, называется фаговой библиотекой (рис. 2).
Рисунок 2. Создание синтетических и природных библиотек антител. За основу библиотеки берутся нуклеотидные последовательности вариабельных доменов антител (иммуноглобулинов, Ig), природные или синтетические. Далее их случайным образом комбинируют, и в результате образуется множество фрагментов антител, на основе которых можно создать фаговую библиотеку .
В современных библиотеках репертуар антител может достигать 10 миллиардов уникальных вариантов . Как же выбрать из этого разнообразия всего несколько молекул, специфичных к одному-единственному антигену? В случае дисплейной библиотеки вирусные частицы работают «библиотекарями», а «читателями» становятся бактериальные клетки. Если бы поиск книг в обычной библиотеке осуществлялся так же, как антител в дисплейной, выглядело бы это весьма необычно. Допустим, перед нами стоит задача выбрать все книги об интересующем нас предмете из библиотеки, в которой находится 10 миллиардов книг: исторические, художественные, сказки, любовные романы в ярких обложках... Для поиска в дисплейной библиотеке не нужно путаться в карточках и заполнять заявку, а нужно всего лишь принести с собой сам этот предмет! И тогда к нему (антигену) тут же начнут подходить библиотекари (фаги) с книгами в руках. Специфичные книги (антитела), которые написаны только о том, что мы принесли с собой, «приклеятся» к антигену намертво, а те, в которых о предмете упоминается вскользь, можно будет без труда унести обратно на полку. После того как с помощью антигена (предмета) были найдены наиболее специфичные молекулы (книги), они передаются бактериям-«читателям». «Читатели» оказываются настолько добросовестными, что не только воспринимают информацию, но и многократно копируют ее. Отбор фагов с фрагментами антител, специфичных к антигену, называется селекцией (рис. 3).
Рисунок 3. Схема селекции. Создание фаговой библиотеки из синтетического или природного источника предполагает образование структур, объединяющих в себе как нуклеотидные, так и аминокислотные последовательности фрагмента антитела (генотип-фенотип-структура ). Затем обеспечивается контакт с антигеном (привязанным к пластику дисплейной библиотеки), который специфически связывается с определенными фрагментами антител, экспонированными на фаговой частице.
Обычно проводится 3–4 раунда селекции, в результате чего отбирается ДНК уже сравнительно небольшого количества фагов, и на ее основе в бактериальных клетках нарабатываются фрагменты антител для дальнейшего анализа. По источнику материала дисплейные библиотеки можно разделить на три группы.
Каждый из перечисленных видов библиотек имеет свои достоинства и недостатки. Например, синтетические библиотеки базируются на небольшом количестве структур вариабельных доменов антител, поэтому работать с ними гораздо проще, чем с природными, которые содержат разнообразные по термодинамическим и экспрессионным характеристикам последовательности. Зато при использовании вариантов из природных библиотек ниже вероятность развития иммунного ответа .
Полученные таким способом молекулы можно подвергнуть изменениям, совершенствуя их свойства. Кроме того, из одного и того же фрагмента антитела можно создать целый ряд терапевтических агентов. В зависимости от цели терапии его можно связать с токсином (например, для борьбы с опухолью), с цитокином (для адресной доставки к больному месту) или с другим фрагментом-помощником, даже с радионуклидом.
Успех современной фармакологии во многом зависит от развития таких областей науки, как молекулярная биология, биоинформатика и генная инженерия. Благодаря этим дисциплинам стало возможным синтезировать нужные последовательности ДНК, комбинировать и изменять их, а также получать животные белки в бактериальных системах. Несомненным достоинством современных технологий является то, что с их помощью можно не только получать аналоги уже существующих антител, но и создавать совершенно новые .
Рано праздновать победу!
Несмотря на все преимущества антител перед малыми молекулами, с их применением возникли проблемы. В 2004 году было обнаружено, что в нескольких случаях прием инфликсимаба (ремикейда, Remicade) - противовоспалительных моноклональных антител - сопровождался развитием у пациентов лимфом. В мае 2006 года в журнале Американской медицинской ассоциации (JAMA ) опубликовали данные, что ремикейд усиливает риск развития рака в три раза . В июне 2008 года FDA сообщило о возможной связи развития лимфом и других видов опухолей у детей и подростков с приемом ремикейда.
Установлено увеличение риска смертельного исхода у онкологических больных при приеме авастина (2,5%) - блокатора фактора роста эндотелия (VEGF) - по сравнению с использованием только химиотерапии (1,7%). Дело в том, что сам по себе Avastin (бевацизумаб) не взаимодействует с раковыми клетками. Он блокирует фактор роста эндотелия (клеток выстилки сосудов), который выделяет опухоль, чтобы создать вокруг себя больше кровеносных сосудов для интенсивного питания. Опухоль выделяет такой же VEGF, как и другие, здоровые части организма, поэтому блокирование роста определенной доли нужных организму сосудов (например, сосудов для питания сердца) оказывается неизбежным. Таким образом, в случае применения авастина повышение смертности пациентов связано не с основным заболеванием, а с сердечной недостаточностью .
Развитие подобных побочных эффектов предсказуемо. Живой организм - очень сложная система, и вмешательство, направленное на одну его часть, влечет за собой изменения в других. Поэтому даже с появлением такого тонкого инструмента, как терапевтические антитела, нельзя говорить об изобретении «идеального лекарства».
Современные протоколы уже основаны на комбинированном подходе к лечению, включая вакцины, химиотерапию и моноклональные антитела. Исследователям еще предстоит разработать такие препараты и схемы терапии, которые обеспечат эффективное и безопасное лечение пациентов.
Рисунки предоставлены российской биофармацевтической компанией «Антерикс».
Литература
- Драг-дизайн: как в современном мире создаются новые лекарства ;. J. Mol. Biol. 376 , 1182–1200;
- Lee C.V., Liang W.C., Dennis M.S., Eigenbrot C., Sidhu S.S., Fuh G. (2004). High-affinity human antibodies from phage-displayed synthetic Fab libraries with a single framework scaffold . J. Mol. Biol. 340 , 1073–1093;
- Lonberg N. (2005). Human antibodies from transgenic animals . Nat. Biotech. 23 , 1117–1125;
- Иванов А.А. и Белецкий И.П. (2011). Терапия моноклональными антителами - панацея или паллиатив ? Ремедиум . 3 , 12–16..
· Лечебные сыворотки.
· Иммуноглобулины.
· Гамма-глобулины.
· Препараты плазмы.
Различают два источника получения специфических сывороточных препаратов:
1) гипериммунизация животных (гетерологичные сывороточные препараты);
2) вакцинация доноров (гомологичные препараты).
2.1. Гетерологичные сывороточные препараты.
Для изготовления гетерологичных сывороточных препаратов используют в основном крупных животных лошадей. Лошади обладают высокой иммунологической реактивностью, от них в срав
нительно короткий срок можно получить сыворотку, содержащую антитела в высоком титре. Кроме этого, введение лошадиного белка человеку дает наименьшее количество побочных реакций. Животные других видов используются редко. Годные к эксплуатации в возрасте от 3 лет
и выше животные подвергаются гипериммунизации, т.е. процессу многократного введения возрастающих доз антигена с целью накопления в крови животных максимального количества антител и поддержания его на достаточном уровне в течение возможно более длительного времени. В период максимального нарастания титра специфических антител в крови животных осуществляют 2-3 кровопускания с интервалом в 2дня. Кровь берут из расчета 1 литр на 50 кг веса лошади из яремной вены в стерильную бутыль, содержащую антикоагулянт. Полученная от лошадей-продуцентов кровь передается в лабораторию для дальнейшей обработки. Плазма отделяется на сепараторах от форменных элементов и дефибринируется раствором хлористого кальция. Использо
вание цельной гетерологичной сыворотки сопровождается аллергическими реакциями в форме сывороточной болезни и анафилаксии. Одним из путей уменьшения побочных реакций сывороточных препаратов, а также повышения их эффективности является их очистка и концентрация. Сыворотку очищают от альбуминов и некоторых глобулинов, которые не относятся к иммунологически активным фракциям сывороточных белков. Иммунологически активными являются псевдоглобулины с электрофоретической подвижностью между гамма- и бета-глобулинами, к этой фракции относятся антитоксические антитела. Также к иммунологически активным фракциям относятся гамма-глобулины, в эту фракцию входят антибактериальные и антивирусные антитела. Очистка сывороток от балластных белков проводится по методу «Диаферм-3». При использовании этого метода сыворотка очищается путем осаждения под влиянием сернокислого аммония и путем пептического переваривания.Помимо метода «Диаферм 3»,разработаны и другие (Ультраферм, Спиртоферм, иммуносорбцииидр.), имеющие ограниченное применение
Содержание антитоксина в антитоксических сыворотках выражается в международных единицах (ME), принятых ВОЗ. Например, 1 ME противостолбнячной сыворотки соответствует ее минимальному количеству, нейтрализующему 1000 минимальных смертельных доз (DLm) столбнячного токсина для морской свинки массой 350 г. 1 ME противоботулинического антитоксина - наименьшее количество сыворотки, нейтрализующее 10000 DLm ботулинического токсина для мышей массой 20 г. 1 ME противодифтерийной сыворотки соответствует ее минимальному количеству, нейтрализующему 100 DLm дифтерийного токсина для морской свинки массой 250 г.
В препаратах иммуноглобулинов IgG является основным компонентом (до 97%). lgA, IgM, IgD входят в препарат в очень малых количествах. Выпускаются также препараты иммуноглобулинов (IgG), обогащенные IgM и IgA. Активность препарата иммуноглобулина выражается в титре специфических антител, определяемых одной из серологических реакций и указывается в наставлении по применению препарата.
Гетерологичные сывороточные препараты применяют для лечения и профилактики инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, их токсинами, вирусами. Своевременное раннее применение сыворотки может не дать развиться болезни, удлиняется срок инкубации, появившееся заболевание имеет более мягкое течение, снижается смертность.
Существенным недостатком использования гетерологичных сывороточных препаратов является возникновение сенсибилизации организма к чужеродному белку. Как указывают исследователи, к глобулинам сыворотки лошади в России сенсибилизировано более 10% населения. В связи с этим повторное введение гетерологичных сывороточных препаратов может сопровождаться осложнениями в виде различных аллергических реакций, самой грозной из которых является анафилактический шок. Для выявления чувствительности пациента к лошадиному белку ставят внутрикожную пробу с разведенной 1:100 лошадиной сывороткой, которую специально изготавливают для этой цели. Перед введением лечебной сыворотки пациенту внутрикожно на сгибательную поверхность предплечья вводят 0,1 мл разведенной лошадиной сыворотки и наблюдают за реакцией в течение 20 минут.
2.2. Гомологичные сывороточные препараты из крови доноров.
Гомологичные сывороточные препараты получают из крови доноров, специально иммунизированных против определенного возбудителя или его токсинов. При введении таких препаратов в организм человека антитела циркулируют в организме несколько дольше, обеспечивая пассивный иммунитет или лечебный эффект в течение 4-5 недель. В настоящее время применяют донорские иммуноглобулины нормальные и специфические и донорскую плазму. Выделение иммунологически активных фракций из донорских сывороток производят с использованием спиртового метода осаждения.
Гомологичные иммуноглобулины практически ареактогенны, поэтому реакции анафилактического типа при повторных введениях гомологичных сывороточных препаратов возникают редко.
2.3.Препараты для бактериальной терапии (эубиотики).
Препараты для бактериальной терапии содержат живые антагонистически активные штаммы бактерий - представителей нормальной микрофлоры. Примером таких препаратов являются лактобактерин, бифи-думбактерин, колибактерин, бификол, бактисубтил и др. Микроорганизмы, содержащиеся в таких препаратах, обладают антагонистическими свойствами по отношению к различным микроорганизмам, прежде всего, к патогенным кишечным микробам. Подобные препараты получаются путем выращивания соответствующих микроорганизмов или их спор в жидких питательных средах с последующим высушиванием под вакуумом из замороженного состояния. Препараты используют для лечения дисбактериоза.
2.4.Препараты лечебных бактериофагов.
Бактериофаги представляют собой вирусы бактерий. Они проникают в бактериальную клетку, размножаются в ней и лизируют ее. На этом основано их применение для лечения и профилактики инфекционных заболеваний. Действие бактериофагов строго специфично и проявляется в отношении определенных видов и типов возбудителя.
Для получения препаратов бактериофагов используют производственные штаммы фагов и соответствующие культуры бактерий. Выращенную в реакторах с жидкой питательной средой бактериальную культуру заражают маточной взвесью фага. При репродукции фаги лизируют бактерии и выходят в питательную среду, такой состав получил название фаголизата. Питательную среду пропускают через бактериальные фильтры для освобождения от остатков бактериальных клеток (фильтрат фаголизата). Фильтрат с бактериофагами консервируют и контролируют на стерильность, безвредность и активность. Готовый препарат, представляющий собой прозрачную жидкость желтого цвета, расфасовывают во флаконы. Наряду с жидким выпускают сухие таблетированные фаги с кислотоустойчивым покрытием, свечи с фагами.
Фаги применяют с лечебной и профилактической целью. В нашей стране выпускаются препараты сальмонеллезного, дизентерийного, ко-ли-протейного, стафилококкового, пиофага и др. В зависимости от заболевания фаги применяют местно в виде орошений, полосканий, примочек, тампонирования, для введения в полость ран, брюшную, плевральную и др. полости, перорально, а также подкожно, внутрикожно и внутримышечно.
2.5 Препараты цитокинов.
Цитокины – это вещества, продуцируемые различными клетками организма и оказывающие неспецифическое иммуностимулирующее действие. Цитокины очень многочисленны и разнообразны, они отличаются механизмами действия, при этом они нормализуют гуморальные и клеточные факторы неспецифической резистентности и влияют на разные стадии и звенья иммунитета. Цитокины могут использоваться в качестве адъювантов в вакцинах и могут быть использованы как самостоятельные препараты.
3. Побочные действия вакцин и сывороток и меры их предупреждения
Применение медицинских иммунобиологических препаратов и, прежде всего, вакцин и сывороток, наряду с выработкой иммунитета способно оказывать на организм неспецифические воздействия, которые могут сопровождаться патологическими процессами, иногда угрожающими жизни человека. Патологические процессы, возникающие после введения иммунобиологических препаратов, согласно схеме С.Г. Дзагурова, делятся на следующие группы:
1) осложнения, связанные с нарушением техники введения препарата, правил асептики в процессе введения препаратов, что приводит к развитию в месте инъекции нагноений, подкожных инфильтратов, абсцессов;
2) аллергические осложнения на введение иммунобиологических препаратов (сывороточная болезнь, анафилактический шок и др.);
3) осложнения вследствие индивидуальной реакции, прежде всего,со стороны ЦНС.
Основная роль в генезе поствакцинальных осложнений принадлежит аллергическим процессам. К наиболее тяжелым поствакцинальным осложнениям при введении иммунобиологических препаратов относятся следующие:
1) анафилактический шок. Развивается чаще всего при повторном парентеральном введении сывороток и вакцин. Относится к общей аллергической реакции немедленного типа. Степень выраженности симптомов шока может быть различной - от легких проявлений до молниеносных смертельных форм. С целью выявления сенсибилизации к гетерогенной сыворотке перед ее введением обязательно проводится кожная проба с лошадиной сывороткой,разведенной 1:100. При выраженной аллергической реакции и тяжелом состоянии больного допускается введение сыворотки после струйного внутривенного введения преднизолона;
2) эндотоксиновый шок. Наблюдается после введения убитых бактериальных вакцин, как проявление повышенной чувствительности организма к эндотоксину;
3)сывороточная болезнь. Является проявлением аллергической реакции организма на введение чужеродного белка, чаще всего лошадиного. Симптомы сывороточной болезни появляются на 7-10 день после введения сывороточных препаратов, но могут отмечаться и в более ранние и поздние сроки;
4)аллергические реакции со стороны кожи. Наиболее часто имеют место после введения АКДС, антирабической и др. вакцин;
5) неврологические поствакцинальные осложнения. Проявляются в форме поражения центральной и периферической нервной системы.
В профилактике всех описанных выше осложнений решающее значение придается выявлению состояний, являющихся противопоказанием для введения в организм иммунобиологических препаратов.