Aplicación práctica de los fagos. Los bacteriófagos se utilizan en el diagnóstico de laboratorio de infecciones para la identificación intraespecífica de bacterias, es decir, la determinación de fagovar (fagotipo). Para ello se utiliza el método de tipificación de fagos, basado en la estricta especificidad de la acción de los fagos: en una placa con una densa medio nutritivo, se siembra el "césped" con un cultivo puro del patógeno y se aplican gotas de varios fagos de tipos específicos de diagnóstico. El fago de una bacteria está determinado por el tipo de fago que provocó su lisis (formación de una mancha estéril, “placa”, o “colonia negativa”, fago). La técnica de fagotipificación se utiliza para identificar el origen y las rutas de propagación de la infección (marcado epidemiológico). El aislamiento de bacterias del mismo fagovar de diferentes pacientes indica una fuente común de infección.

Los fagos también se utilizan para tratar y prevenir una serie de infecciones bacterianas. Producen tifoidea, salmonella, disentería, pseudomonas, fagos estafilocócicos, estreptocócicos y preparados combinados (coliproteus, piobacteriófagos, etc.). Los bacteriófagos se prescriben según indicaciones por vía oral, parenteral o tópica en forma de líquido, tabletas, supositorios o aerosoles.

Los bacteriófagos se utilizan ampliamente en ingeniería genética y biotecnología como vectores para producir ADN recombinante.

Las preparaciones de bacteriófagos utilizadas en la práctica son un filtrado de un caldo de cultivo de los microbios correspondientes lisados ​​por el fago, que contiene partículas de fagos vivos, así como antígenos bacterianos disueltos liberados de las células bacterianas durante su lisis. La preparación resultante, un bacteriófago líquido, debe verse como un líquido completamente transparente. amarillo mayor o menor intensidad.

Para su uso con fines terapéuticos y profilácticos, los fagos se pueden producir en forma de tabletas con un recubrimiento resistente a los ácidos. Los fagos secos granulados son más estables durante el almacenamiento y cómodos de usar. Una tableta de bacteriófago seco corresponde a 20-25 ml. preparación liquida. La vida útil de las preparaciones secas y líquidas es de 1 año. El bacteriófago líquido debe almacenarse a una temperatura de + 2 +10 C, seco, no superior a +1 ° C, pero se puede almacenar en el refrigerador a temperaturas negativas.

El bacteriófago por vía oral permanece en el cuerpo durante 5 a 7 días. Como regla general, la ingesta de un bacteriófago no va acompañada de reacciones ni complicaciones. No existen contraindicaciones de uso. Se utilizan en forma de irrigaciones, enjuagues, lociones, tampones, inyecciones y también se administran en las cavidades: abdominal, pleural, articular y vejiga, dependiendo de la ubicación del patógeno.

Los fagos de diagnóstico se producen tanto en forma líquida como seca en ampollas. Antes de comenzar a trabajar, el bacteriófago seco se diluye. Si el título, tr, está indicado en las ampollas, la DRT (dosis de título de trabajo) se utiliza en la reacción de fagolización (método Otto) para identificar bacterias, si se indica el tipo de fago, luego para la tipificación de fagos, para determinar la fuente; de infección.

El efecto de un bacteriófago en un cultivo microbiano en medio líquido y en medio sólido.

Método Otto (gota que gotea)

Siembre espesamente el césped del cultivo en estudio. De 5 a 10 minutos después de la siembra, se aplica un fago de diagnóstico líquido a la superficie seca del medio nutritivo. El plato se inclina ligeramente para que una gota de fago se extienda sobre la superficie del agar. La taza se coloca en un termostato durante 18-24 horas. El resultado se mide por la ausencia total de crecimiento del cultivo en el sitio donde se aplica la gota del fago.

Experimento en medio nutritivo líquido.

El cultivo en estudio se inocula en dos tubos de ensayo con medio líquido. Se añade un bacteriófago de diagnóstico con un asa a un tubo de ensayo (“O”). Después de 18-20 horas, en un tubo de ensayo donde no se agregó el bacteriófago ("K"), se observa una fuerte turbidez del caldo: el cultivo inoculado ha crecido. El caldo del tubo de ensayo al que se añadió el bacteriófago permaneció transparente debido a la lisis del cultivo bajo su influencia.

Fagotipificación de bacterias

Según el espectro de acción, se distinguen los siguientes bacteriófagos: especies de bacterias polivalentes relacionadas con la lisis; bacterias monovalentes lisantes cierto tipo; típico, lisante tipos individuales(variantes) de bacterias.

Por ejemplo, una cepa de estafilococo patógeno puede ser lisada por varios tipos de fagos, por lo que todos los fagos típicos (24) y cepas de estafilococos patógenos se combinan en 4 grupos.

El método de tipificación de fagos tiene gran valor para la investigación epidemiológica, ya que nos permite identificar el origen y las rutas de propagación de patógenos. Para ello, el virus del fago se determina a partir de un cultivo puro aislado de material patológico en medios nutritivos sólidos utilizando fagos de diagnóstico estándar.

El fagovar de un cultivo de microorganismos está determinado por el fago típico que provocó su lisis. El aislamiento de bacterias del mismo fagovar de diferentes sujetos indica la fuente de infección.

Por primera vez se asumió que los bacteriófagos son virus. D. Errel. Posteriormente, se descubrieron virus fúngicos, etc., que pasaron a ser conocidos como fagos.

Morfología del fago.

Dimensiones - 20 - 200 nm. La mayoría de los fagos tienen forma de renacuajo. Los fagos más complejos constan de una cabeza multifacética, en la que se encuentra el ácido nucleico, un cuello y prolongaciones. Al final del proceso hay una placa basal, de la que salen hilos y dientes. Estos hilos y dientes sirven para unir el fago a la membrana bacteriana. En los fagos organizados más complejamente, la parte distal del proceso contiene la enzima: lisozima. Esta enzima promueve la disolución de la membrana bacteriana durante la penetración del fago NK en el citoplasma. En muchos fagos, el proceso está rodeado por una vaina, que en algunos fagos puede contraerse.

Hay 5 grupos morfológicos.

1. Bacteriófagos con un proceso largo y una vaina contráctil.
2. Fagos con un proceso largo pero sin vaina contráctil.
3. Fagos de rama corta
4. Fagos con un proceso análogo.
5. fagos filamentosos

Composición química.

Los fagos están compuestos de ácido nucleico y proteínas. La mayoría de ellos contienen ADN de 2 cadenas cerradas en un círculo. Algunos fagos contienen una sola hebra de ADN o ARN.

Concha de fago - cápside, consta de subunidades proteicas ordenadas: capsómeros.

En los fagos organizados más complejamente, la parte distal del proceso contiene la enzima: lisozima. Esta enzima promueve la disolución de la membrana bacteriana durante la penetración del fago NK en el citoplasma.

Los fagos toleran bien la congelación, el calentamiento a 70ºC y el secado. Sensible a los ácidos, a los rayos UV y a la ebullición. Los fagos infectan bacterias estrictamente definidas interactuando con receptores celulares específicos.

Según la especificidad de la interacción. -

Polífagos: interactúan con varias especies de bacterias relacionadas.

Los monófagos (fagos específicos de cada especie) interactúan con un tipo de bacteria.

Tipo fagos: interactúan con variantes individuales de bacterias dentro de una especie.

Según la acción de los fagos típicos, las especies se pueden dividir en serie de fagos. La interacción de los fagos con las bacterias puede ocurrir a través de tipo productivo, aproductivo e integrador.

tipo productivo- Se forma una progenie de fagos y la célula se lisa.

Con un productivo- la célula continúa existiendo, el proceso de interacción se interrumpe en la etapa inicial

tipo integrativo- el genoma del fago se integra en el cromosoma bacteriano y coexiste con él.

Dependiendo de los tipos de interacción, distinguen fagos virulentos y templados.

Virulento interactuar con las bacterias de manera productiva. En primer lugar, la absorción del fago en la membrana bacteriana se produce debido a la interacción de receptores específicos. Hay penetración o penetración del ácido nucleico viral en el citoplasma de las bacterias. Bajo la influencia de la lisozima, se forma un pequeño agujero en la cubierta bacteriana, la cubierta del fago se contrae y se inyecta NK. La cubierta del fago fuera de la bacteria. A continuación, se produce la síntesis de las primeras proteínas. Aseguran la síntesis de proteínas estructurales de los fagos, la replicación del ácido nucleico de los fagos y la represión de la actividad de los cromosomas bacterianos.

Después de esto, se produce la síntesis. componentes estructurales Fagos y replicación de ácidos nucleicos. A partir de estos elementos se ensambla una nueva generación de partículas de fagos. El ensamblaje se llama morfogénesis, nuevas partículas, de las cuales se pueden formar entre 10 y 100 en una bacteria. Lo siguiente es la lisis de las bacterias y la liberación de una nueva generación de fagos al ambiente externo.

Bacteriófagos templados interactuar ya sea de manera productiva o integradora. El ciclo productivo procede de manera similar. Con la interacción integrativa, el ADN de un fago templado, después de ingresar al citoplasma, se integra en el cromosoma en un área determinada, y durante la división celular se replica sincrónicamente con el ADN bacteriano y estas estructuras se transmiten a las células hijas. Tal ADN fago incorporado - profago, y una bacteria que contiene un profago se llama lisogénica, y el fenómeno es lisogenia.

Espontáneamente o bajo la influencia de una serie de factores externos El profago se puede cortar del cromosoma, es decir. pasar a un estado libre, exhibir las propiedades de un fago virulento, lo que conducirá a la formación de una nueva generación de cuerpos bacterianos. inducción de profago.

La lisogénesis de las bacterias subyace a la conversión de fagos (lisogénica). Esto se entiende como un cambio en las características o propiedades de las bacterias lisogénicas en comparación con las bacterias no lisogénicas de la misma especie. Sujeto a cambios diferentes propiedades- morfológico, antigénico, etc.

Los fagos templados pueden ser defectuosos: incapaces de formar progenie de fagos no en condiciones naturales ni en inducción.

El virión es una partícula viral completa que consta de NK y una capa de proteína.

Aplicación práctica de los fagos.

1. Aplicación en diagnóstico. En relación con varias especies bacterianas, los monófagos se utilizan en la reacción de fagolización como uno de los criterios para identificar un cultivo bacteriano; los fagos típicos se utilizan para la fagotipación y para la diferenciación intraespecífica de bacterias. Realizado con fines epidemiológicos, para establecer la fuente de infección y las formas de eliminarla.
2. Para el tratamiento y prevención de una serie de infecciones bacterianas: infecciones de tipo abdominal, estafilocócicas y estreptocócicas (tabletas resistentes a los ácidos)
3. Los bacteriófagos templados se utilizan en ingeniería genética como vector capaz de introducir material genético en una célula viva.

Genética de bacterias

El genoma bacteriano consta de elementos genéticos capaces de autorreproducirse. replicones. Los replicones son cromosomas y plásmidos bacterianos. El cromosoma bacteriano forma un nucleoide, un anillo cerrado no asociado con proteínas y porta un conjunto de genes haploides.

Un plásmido también es un anillo cerrado de una molécula de ADN, pero de tamaño mucho más pequeño que un cromosoma. La presencia de plásmidos en el citoplasma de las bacterias no es necesaria, pero aportan una ventaja en el medio ambiente. Los plásmidos grandes se reducen con el cromosoma y su número en la célula es pequeño. Y la cantidad de pequeños plásmidos puede llegar a varias docenas. Algunos plásmidos son capaces de integrarse reversiblemente en el cromosoma bacteriano en una determinada región y funcionar como un único replicón. Estos plásmidos se denominan integrativos. Algunos plásmidos pueden transmitirse de una bacteria a otra mediante contacto directo: los plásmidos conjugativos. Contienen genes responsables de la formación de pilas F, que forman un puente conjugativo para la transferencia de material genético.

Los principales tipos de plásmidos son

F - plásmido congativo integrativo. El factor sexo determina la capacidad de las bacterias para ser donantes durante la conjugación.

R - plásmidos. Resistente. Contiene genes que determinan la síntesis de factores que destruyen. medicamentos antibacterianos. Las bacterias que poseen tales plásmidos no son sensibles a muchos fármacos. Por tanto, se forman factores resistentes a los medicamentos.

Tox plásmido - factores determinantes de la patogenicidad -

Ent (plásmidos) contiene un gen para la producción de enterotoxinas.

Hly: destruye los glóbulos rojos.

Elementos genéticos móviles. Estos incluyen la inserción - elementos de inserción. La designación generalmente aceptada es Is. Se trata de secciones de ADN que pueden moverse tanto dentro del replicón como entre ellos. Contienen sólo los genes necesarios para su propio movimiento.

Transposones- estructuras más grandes que tienen las mismas propiedades que Is, pero además contienen genes estructurales que determinan la síntesis sustancias biológicas, como las toxinas. Los elementos genéticos móviles pueden provocar la inactivación de genes, daños al material genético, fusión de replicones y la propagación de genes a través de una población bacteriana.

Variabilidad en las bacterias.

Todos los tipos de variabilidad se dividen en 2 grupos: no hereditarios (fenotípico, modificación) y hereditarios (genotípicos).

Modificaciones- cambios fenotípicos no heredados en rasgos o propiedades. Las modificaciones no afectan al genotipo y por tanto no se heredan. Son reacciones adaptativas a cambios en algunas condiciones especificas ambiente externo. Como regla general, se pierden en la primera generación, después de que el factor deja de actuar.

Variabilidad genotípica Afecta el genotipo del organismo y, por tanto, puede transmitirse a la descendencia. La variabilidad genotípica se divide en mutaciones y recombinaciones.

Mutaciones- cambios persistentes y hereditarios en las características o propiedades de un organismo. La base de las mutaciones es un cambio cualitativo o cuantitativo en la secuencia de nucleótidos en una molécula de ADN. Las mutaciones pueden cambiar casi cualquier propiedad.

Por origen, las mutaciones son espontáneas e inducidas.

Mutaciones espontáneas ocurre en las condiciones naturales de existencia del organismo, y inducido surgen como resultado de la acción dirigida de un factor mutagénico. Según la naturaleza de los cambios en la estructura primaria del ADN en las bacterias, se distinguen mutaciones genéticas o puntuales y aberraciones cromosómicas.

Mutaciones genéticas ocurren dentro de un solo gen y involucran mínimamente un nucleótido. Este tipo de mutación puede ser el resultado de la sustitución de un nucleótido por otro, la pérdida de un nucleótido o la inserción de uno extra.

Cromosómico- puede afectar a varios cromosomas.

Puede haber una deleción (la pérdida de una sección de un cromosoma) o una duplicación (la duplicación de una sección de un cromosoma). Girar una sección de un cromosoma 180 grados es una inversión.

Cualquier mutación ocurre bajo la influencia de un determinado factor mutagénico. Por su naturaleza, los mutágenos son físicos, químicos y biológicos. Radiaciones ionizantes, rayos X, rayos UV. Los mutágenos químicos incluyen análogos de las bases nitrogenadas, el propio ácido nitroso e incluso algunos fármacos, los citostáticos. Biológico: algunos virus y transfasones.

Recombinación- intercambio de secciones de cromosomas

Transducción: transferencia de material genético mediante un bacteriófago.

Reparación de material genético - restauración del daño resultante de mutaciones.

Hay varios tipos de reparación.

1. Fotorreactivación: este proceso está garantizado por una enzima especial que se activa en presencia de luz visible. Esta enzima se mueve a lo largo de la cadena de ADN y repara los daños. Combina temporizadores que se forman bajo la acción de los rayos UV. Los resultados de la reparación oscura son más significativos. No depende de la luz y lo proporcionan varias enzimas: primero, las nucleasas cortan la sección dañada de la cadena de ADN, luego la ADN polimerasa, en la matriz de la cadena complementaria conservada, sintetiza un parche y las ligasas cosen el parche en la zona dañada.

Las reparaciones están sujetas a mutaciones genéticas, pero los cromosómicos generalmente no lo son

1. Recombinación genética en bacterias. Se caracterizan por la penetración de material genético de la bacteria donante en la bacteria receptora con la formación de un genoma hijo que contiene los genes de ambos individuos originales.

La incorporación de un fragmento de ADN del donante al receptor se produce mediante el entrecruzamiento.

Tres tipos de transmisión -

1. Transformación- un proceso en el que se transfiere un fragmento de ADN de un donante aislado. Depende de la competencia del receptor y del estado del ADN del donante. Competencia- capacidad de absorber ADN. Depende de la presencia en membrana celular Receptor de proteínas especiales y se forma durante ciertos períodos de crecimiento bacteriano. El ADN del donante debe ser bicatenario y no de tamaño muy grande. El ADN del donante penetra la membrana bacteriana y una de las cadenas se destruye y la otra se integra en el ADN del receptor.
2. Transducción- realizado con la ayuda de bacteriófagos. Transducción general y transducción específica.

General - Ocurre con la participación de factores de virulencia. Durante el ensamblaje de partículas de fagos, la cabeza del fago puede incluir por error no el ADN del fago, sino una parte del cromosoma bacteriano. Estos fagos son fagos defectuosos.

Específico- lo llevan a cabo fagos templados. Al cortar, el corte se realiza estrictamente a lo largo de la frontera entre ciertos genes y se transfieren.

1. Conjugación- transferencia de material genético de la bacteria donante al receptor, tras su contacto directo. Una condición necesaria es la presencia de un plásmido congativo en la célula donante. Durante la conjugación, se forma un puente de conjugación debido a los pili, a través del cual se transfiere el material genético del donante al paciente.

Diagnóstico genético

Conjunto de métodos que permiten identificar el genoma de un microorganismo o su fragmento en el material en estudio. El método de hibridación NC fue el primero en proponerse. Basado en el uso del principio de complementariedad. Este método permite detectar la presencia de fragmentos marcadores de ADN del patógeno en el material genético mediante sondas moleculares. Las sondas moleculares son cadenas cortas de ADN complementarias a la región marcadora. Se introduce una etiqueta en la sonda: un fluorosoma, un isótopo radiactivo, una enzima. El material en estudio se somete a un tratamiento especial que le permite destruir microorganismos, liberar ADN y dividirlo en fragmentos monocatenarios. Después de esto, se fija el material. Entonces se detecta la actividad de la etiqueta. Este método no es muy sensible. Es posible identificar el patógeno sólo si su cantidad es suficientemente grande. 10 a 4 microorganismos. Es bastante complejo técnicamente y requiere una gran cantidad de sondas. No ha encontrado un uso generalizado en la práctica. fue desarrollado nuevo método - polimerasa reacción en cadena- PCR.

Este método se basa en la capacidad del ADN y el ARN viral para replicarse, es decir. a la autorreproducción. La esencia del paciente es la copia repetida: amplificación in vitro de un fragmento de ADN, que es un marcador de un microorganismo determinado. Dado que el proceso se lleva a cabo a suficiente altas temperaturas 70-90, el método fue posible después del aislamiento de la ADN polimerasa termoestable de bacterias termófilas. El mecanismo de amplificación es tal que la copia de las cadenas de ADN no comienza en ningún punto, sino sólo en determinados bloques de partida, para cuya creación se utilizan los llamados cebadores. Los cebadores son secuencias de polinucleótidos complementarias a las secuencias terminales del fragmento copiado del ADN deseado, y los cebadores no sólo inician la amplificación, sino que también la limitan. Ahora existen varias opciones de PCR, caracterizadas por 3 etapas:

1. Desnaturalización del ADN (división en fragmentos de 1 cadena)
2. Colocando la imprimación.
3. Adición complementaria de cadenas de ADN a cadenas dobles.

Este ciclo dura entre 1,5 y 2 minutos. Como resultado, el número de moléculas de ADN se duplica entre 20 y 40 veces. El resultado es 10 elevado a la octava potencia de copias. Después de la amplificación, se realiza una electroforesis y se aísla en forma de franjas. Se lleva a cabo en un dispositivo especial llamado amplificador.

Ventajas de la PCR

1. Da indicaciones directas de la presencia de un patógeno en el material de prueba, sin aislar un cultivo puro.
2. Muy alta sensibilidad. En teoría, se puede detectar el 1er.
3. El material de investigación puede desinfectarse inmediatamente después de su recogida.
4. 100% especificidad
5. Resultados rápidos. Análisis completo: 4-5 horas. Método expreso.

Se utiliza ampliamente para el diagnóstico de enfermedades infecciosas cuyos agentes causantes son organismos que no se pueden cultivar o son difíciles de cultivar. Clamidia, micoplasma, muchos virus: hepatitis, herpes. Se han desarrollado sistemas de prueba para determinar ántrax, tuberculosis.

Análisis de restricciones- con la ayuda de enzimas, la molécula de ADN se separa según determinadas secuencias de nucleoides y los fragmentos se analizan en función de su composición. De esta forma podrás encontrar zonas únicas.

Biotecnología e ingeniería genética.

La biotecnología es una ciencia que, a partir del estudio de los procesos vitales de los organismos vivos, utiliza estos bioprocesos, así como los propios objetos biológicos, para la producción industrial de productos necesarios para el ser humano, para reproducir bioefectos que no se manifiesten en formas no naturales. condiciones. Los microorganismos unicelulares, así como las células de animales y plantas, se utilizan con mayor frecuencia como objetos biológicos. Las células se reproducen muy rápidamente, lo que permite poco tiempo aumentar la biomasa del productor. Actualmente, la biosíntesis de sustancias complejas, como proteínas, antibióticos, es más económica y tecnológicamente accesible que otro tipo de materias primas.

La biotecnología utiliza las propias células como fuente del producto objetivo, así como grandes moléculas sintetizadas por la célula, enzimas, toxinas, anticuerpos y metabolitos primarios y secundarios: aminoácidos, vitaminas, hormonas. La tecnología para la obtención de productos de síntesis microbiana y celular se reduce a varias etapas típicas: selección o creación de una sede productiva. Selección de medio nutritivo óptimo, cultivo. Aislamiento del producto objetivo, su purificación, estandarización, dando forma de dosificación. La ingeniería genética se reduce a la creación de productos específicos necesarios para los humanos. El gen diana resultante se fusiona con un vector, y el vector puede ser un plásmido y se inserta en la célula receptora. Receptor - bacterias - E. coli, levadura. Los productos objetivo sintetizados por recombinantes se aíslan, purifican y utilizan en la práctica.

Los primeros en crearse fueron la insulina y el interferón humano. Eritropoyetina, hormona del crecimiento, anticuerpos monoclonales. Vacuna contra la hepatitis B.

Bacteriófagos(fagos) (de φᾰγω - “Yo devoro”) son virus que infectan selectivamente células bacterianas. Muy a menudo, los bacteriófagos se multiplican dentro de las bacterias y provocan su lisis. Un bacteriófago consta de una cubierta proteica y material genético de ácido nucleico. Los bacteriófagos son los grupos de virus más numerosos, más extendidos en la biosfera y, presumiblemente, el más antiguo evolutivamente. En condiciones naturales, los fagos se encuentran en lugares donde hay bacterias sensibles a ellos. Cuanto más rico en microorganismos es un sustrato particular (suelo, excreciones humanas y animales, agua, etc.), mayor es el número de fagos correspondientes que se encuentran en él. Los bacteriófagos actúan papel importante en el control de poblaciones microbianas, en la autólisis de células envejecidas, en la transferencia de genes bacterianos. Los bacteriófagos son uno de los principales elementos genéticos móviles. Mediante la transducción, introducen nuevos genes en el genoma bacteriano. Se ha estimado que en 1 segundo se pueden infectar 1024 bacterias. Esto significa que la transferencia constante de material genético se distribuye entre bacterias que viven en condiciones similares.

Inicialmente, los bacteriófagos se unen a receptores específicos de fagos en la superficie de la célula bacteriana. La cola del fago, con la ayuda de enzimas ubicadas en su extremo, disuelve localmente la membrana celular, se contrae y el ADN contenido en la cabeza se inyecta en la célula, mientras que la cubierta proteica del bacteriófago permanece afuera. La duración de este proceso puede variar desde varios minutos hasta varias horas. Luego se produce la lisis celular y se liberan nuevos bacteriófagos maduros. A veces, el fago inicia un ciclo de lisis, que da como resultado la lisis celular y la liberación de nuevos fagos. Por tanto, el genoma viral se replica sincrónicamente con el ADN del huésped y la división celular, y este estado del fago se denomina profago. Una bacteria que contiene un profago se vuelve lisogénica hasta que, bajo ciertas condiciones o de forma espontánea, se estimula al profago para que experimente un ciclo de replicación lítica.

Aplicación de bacteriófagos en medicina.

Una de las áreas de uso de los bacteriófagos es la terapia antibacteriana, alternativa a la recepción antibióticos. Por ejemplo, se utilizan bacteriófagos: estreptocócico, estafilocócico, klebsiella, disentería polivalente, piobacteriófago, coli, proteus y coliproteus y otros. Los bacteriófagos también se utilizan en ingeniería genética como vectores que transfieren secciones de ADN. También es posible la transferencia natural de genes entre bacterias a través de algunos fagos (transducción). Los vectores de fagos generalmente se crean basándose en el ADN que contiene el bacteriófago templado λ. La reproducción de un bacteriófago sólo es posible en células vivas. Los bacteriófagos se pueden utilizar para determinar la viabilidad de las bacterias. esta direccion tiene grandes perspectivas, ya que una de las principales cuestiones en diversos procesos biotecnológicos es determinar la viabilidad de los cultivos utilizados. Mediante el método de análisis electroóptico de suspensiones celulares se demostró la posibilidad de estudiar las etapas de interacción entre bacteriófagos y microorganismos.

"Fagodermo"

La empresa NPC "MikroMir" ha desarrollado una preparación combinada de fagos " Fagodermo"(), destinado a la prevención y el tratamiento de complicaciones inflamatorias purulentas en cirugía y infecciones de heridas causada por cepas patógenas.

El medicamento está disponible en forma de gel y liofilizado. La preparación en gel se utiliza en forma de aplicaciones en el área afectada de la piel, membranas mucosas y tejido subcutáneo 1-2 veces al día hasta la recuperación. Puede aplicar el medicamento a los apósitos. No es aconsejable utilizar el medicamento junto con pomadas.

El medicamento liofilizado se prepara inmediatamente antes de su uso: se agrega 1 ml de solución salina estéril al frasco con el medicamento liofilizado y se agita bien el contenido del frasco; la solución transparente preparada se añade a 50 ml de solución salina estéril, que se utiliza para enjuague, drenaje y aplicación.

El medicamento no tiene contraindicaciones y efectos secundarios. Conservar a +4ºС.

El medicamento se utiliza para la prevención y el tratamiento de las siguientes enfermedades de la piel y las membranas mucosas:

• Complicaciones inflamatorias purulentas durante procedimientos y operaciones cosméticos;
• Estafilo-estreptodermia;
• furunculosis;
• Acné;
• Acné;
• Complicaciones inflamatorias purulentas en eczema y otras lesiones cutáneas;
• Infecciones de heridas;
• Para curar grietas y erosiones;
• Dermatitis alérgica;
• Mordeduras de insectos y animales;
• Peines;
• Quemaduras térmicas;
• Sicosis estafilocócica.

El fármaco con bacteriófagos elimina la picazón de la piel. Al tratar las axilas y las piernas, el medicamento elimina el olor desagradable en mucho tiempo. "Fagoderm" es un agente preventivo eficaz en la higiene personal (tratamiento de manos, órganos genitourinarios, zona rectal para hemorroides).

Bacteriófagos, aplicación en medicina.

Bacteriófagos. Aplicación en la práctica médica.

Los bacteriófagos son virus bacterianos capaces de penetrar específicamente en las células bacterianas, reproducirlas y provocar su lisis.

Se encuentran dondequiera que haya bacterias: en el suelo, el agua y el tracto intestinal humano. El fago tiene todas las características biológicas características de los virus.

Morfología de los fagos:

Los fagos varían en forma: filamentosos, esféricos, cúbicos, fagos con cabeza y cola (se parecen a un espermatozoide).

Por tamaño: pequeño, mediano y grande.

Las estructuras más complejas son los fagos grandes, que constan de una cabeza y una cola. La cabeza tiene forma de icosaedro. La cabeza se conecta al proceso mediante un collar y un paraguas. En el interior del proceso hay una varilla cilíndrica hueca que se comunica con la cabeza; en el exterior, el proceso tiene una vaina proteica capaz de contraerse; el proceso de la cola termina en una placa basal hexagonal con espinas cortas, desde donde se extienden estructuras de fibrillas en forma de hilos; . La placa y las espinas contienen lisozima. El proceso tiene 6 vellosidades, que aseguran una fuerte unión del fago a la célula bacteriana. Puede haber fagos con una vaina no contráctil, fagos con procesos cortos, fagos con un proceso análogo y fagos sin proceso.

Composición química:

Resistencia a los fagos: los fagos toleran temperaturas de 50-60°C. Pueden resistir la congelación y morir a una temperatura de 70°C. No se ven afectados por venenos como el cianuro, el fluoruro, el cloroformo y el fenol. Los fagos se conservan bien en ampollas selladas, pero pueden destruirse mediante ebullición, exposición a ácidos o irradiación ultravioleta.

El mecanismo de interacción de los fagos con una célula microbiana:

Según sus interacciones, se distinguen fagos virulentos y templados.

Fagos virulentos: penetran en la célula bacteriana, se reproducen y provocan la lisis de las bacterias.

Los fagos con un proceso y una vaina contraída tienen varias características:

Estos fagos se adsorben en la superficie de la célula bacteriana mediante fibrillas de proceso en presencia de receptores apropiados. Luego se activa la enzima ATPasa, lo que conduce a la contracción de la vaina del proceso caudado y a la introducción de una varilla hueca en la célula. Una enzima, la lisozima, participa en el proceso de perforación de las paredes celulares.

El ADN del fago pasa a través del eje hueco del apéndice y se inyecta en la célula. La cápside y la apófisis permanecen en la superficie celular. Luego, la proteína del fago y el ácido nucleico se reproducen dentro de la célula. La siguiente etapa es el ensamblaje y formación de partículas de fagos maduros. La etapa final: lisis celular y liberación de partículas de fagos maduros. La lisis puede ocurrir tanto desde el interior: la pared celular se rompe y los fagos maduros salen al interior. ambiente externo y desde el exterior, los fagos hacen muchos agujeros en la pared celular a través de los cuales fluye el contenido de la célula; con tal lisis, el fago no se multiplica;

Los fagos moderados no lisan todas las células de la población; entran en simbiosis con algunas células, como resultado de lo cual el ADN del fago se integra en el cromosoma de la célula. En este caso, el genoma del fago se llama profago.

El profago pasa a formar parte del cromosoma de la célula y, durante su reproducción, se replica de forma sincrónica con el genoma de la célula, sin provocar su lisis y se transmite a la descendencia.

El fenómeno de simbiosis de una célula microbiana con un profago se llama lisogenia.

Y el cultivo de bacterias que contiene profago es lisogénico, este nombre refleja la capacidad del profago de forma espontánea o bajo la influencia de factores. ambiente pasar al citoplasma y comportarse como un fago virulento que lisa las bacterias. Al pasar a una forma virulenta, un fago templado puede capturar parte del cromosoma de una célula bacteriana y, tras la lisis, transferirlo a otra.

Los fagos se dividen según su espectro de acción:

1. Polivalente: lisa bacterias relacionadas (el fago de salmonella lisa solo salmonella).

2.Especies (monófagos): lisan bacterias de una sola especie.

3. Específico de tipo: lisa selectivamente variantes individuales de bacterias dentro de una especie (patógeno Staphylococcus - 33 conjuntos).

Aplicación práctica:

Las preparaciones de fagos se utilizan para el tratamiento y prevención de infecciones y su diagnóstico. La acción de los fagos se basa en su estricta especificidad; para obtener la preparación de fagos se utilizan cepas industriales y los correspondientes cultivos bacterianos.

Formas de liberación: líquida, seca, tabletas, aerosoles, supositorios. Se introducen en el organismo por vía parenteral, enteral y local. Utilizado con fines terapéuticos y profilácticos en varias enfermedades(disentería, cólera, diversas enfermedades inflamatorias purulentas).

Diagnóstico de fagos: el principio de diagnóstico se basa en el cultivo conjunto de cultivos de prueba con fagos conocidos y desconocidos, el resultado se considera positivo si hay lisis de la célula bacteriana; La lisis se puede observar en medios nutritivos líquidos y sólidos. En medios nutritivos líquidos, aparece una aclaración de la suspensión bacteriana, y en medios densos, se forman áreas de falta de crecimiento.

Tipificación de fagos: determinación de la variante tipo de una especie utilizando un conjunto de fagos tipo. Se producen fagos tifoideos, fagos para diagnosticar el cólera, fagos de salmonella y fagos de disentería. La fagotipificación es necesaria al realizar análisis epidemiológicos de la enfermedad y para establecer el origen y las vías de transmisión. Al detectar el fago, se juzga el contenido de los microorganismos correspondientes.

Sobre los autores

Valentin Viktorovich Vlasov— Académico de la Academia de Ciencias de Rusia, Doctor en Ciencias Químicas, Profesor, Director del Instituto biología química y medicina fundamental de la SB RAS (Novosibirsk). Laureado con el Premio Estatal de la Federación de Rusia (1999). Autor y coautor de más de 300 artículos científicos y 20 patentes.

Vera Vitalyevna Morozova— Candidato de Ciencias Biológicas, senior becario de investigación Laboratorio de Microbiología Molecular del Instituto de Biología Química y Medicina Fundamental SB RAS (Novosibirsk). Autor de más de 30 artículos científicos y 6 patentes.

Ígor Viktorovich Babkin— Candidato de Ciencias Biológicas, investigador principal del Laboratorio de Microbiología Molecular del Instituto de Biología Química y Medicina Fundamental SB RAS (Novosibirsk). Autor y coautor de 58 artículos científicos y 2 patentes.

Nina Viktorovna Tikunova— Doctor en Ciencias Biológicas, Jefe del Laboratorio de Microbiología Molecular del Instituto de Biología Química y Medicina Fundamental SB RAS (Novosibirsk). Autor y coautor de 120 artículos científicos y 21 patentes.

A mediados del siglo pasado, la ciencia biológica dio un paso revolucionario al establecer las bases moleculares para el funcionamiento de los sistemas vivos. Un papel muy importante en la exitosa investigación que condujo a la definición naturaleza química Las moléculas hereditarias, el descifrado del código genético y la creación de tecnologías para la manipulación genética fueron desempeñados por los bacteriófagos, descubiertos a principios del siglo pasado. Hoy en día, estos virus bacterianos han dominado muchas "profesiones" útiles para los humanos: se utilizan no sólo como medicamentos antibacterianos seguros, sino también como desinfectantes e incluso como base para la creación de nanodispositivos electrónicos.

Cuando en la década de 1930 un grupo de científicos abordó los problemas del funcionamiento de los sistemas vivos y luego, en la búsqueda de los modelos más simples, prestaron atención a bacteriófagos- bacterias virus. Después de todo, entre los objetos biológicos no hay nada más simple que los bacteriófagos; además, se pueden cultivar y analizar fácil y rápidamente, y los programas genéticos virales son pequeños.

Un fago es una estructura natural de tamaño mínimo que contiene un programa genético muy compacto (ADN o ARN), en el que no hay nada superfluo. Este programa está encerrado en una cubierta de proteína equipada con un conjunto mínimo de dispositivos para su administración dentro de la célula bacteriana. Los bacteriófagos no pueden reproducirse por sí solos y, en este sentido, no pueden considerarse objetos vivos de pleno derecho. Sus genes comienzan a funcionar solo en bacterias, utilizando los sistemas biosintéticos disponibles en la célula bacteriana y las reservas de moléculas necesarias para la síntesis. Sin embargo, los programas genéticos de estos virus no son fundamentalmente diferentes de los de más organismos complejos Por tanto, los experimentos con bacteriófagos permitieron establecer los principios fundamentales de la estructura y funcionamiento del genoma.

Posteriormente, este conocimiento y los métodos desarrollados durante la investigación se convirtieron en la base para el desarrollo de tecnologías biológicas y ciencia médica, así como una amplia gama de aplicaciones biotecnológicas.

Luchadores de patógenos

Los primeros intentos de utilizar bacteriófagos para tratar enfermedades infecciosas se realizaron casi inmediatamente después de su descubrimiento, pero la falta de conocimiento y las biotecnologías imperfectas de esa época no permitieron lograr un éxito completo. Sin embargo, la práctica clínica posterior ha demostrado la posibilidad fundamental de un uso exitoso de los bacteriófagos en enfermedades infecciosas. tracto gastrointestinal, sistema genitourinario, para afecciones purulentas-sépticas agudas de pacientes, para el tratamiento de infecciones quirúrgicas, etc.

En comparación con los antibióticos, los bacteriófagos tienen una serie de ventajas: no causan efectos secundarios y además son estrictamente específicos para ciertos tipos de bacterias, por lo que su uso no altera el microbioma humano normal. Sin embargo, una selectividad tan alta también crea problemas: para tratar con éxito a un paciente, es necesario conocer exactamente el agente infeccioso y seleccionar el bacteriófago individualmente.

Los fagos también se pueden utilizar de forma profiláctica. De ahí el nombre del Instituto de Investigación de Epidemiología y Microbiología de Moscú. G. N. Gabrichevsky desarrolló un producto preventivo "FUDFAG" basado en un cóctel de bacteriófagos, que reduce el riesgo de contraer infecciones intestinales agudas. Los estudios clínicos han demostrado que el uso semanal del medicamento le permite deshacerse de la hemolización. coli y otras bacterias patógenas y oportunistas que provocan disbiosis intestinal.

Los bacteriófagos se utilizan para tratar enfermedades infecciosas no solo de humanos, sino también de animales domésticos y de granja: mastitis en vacas, colibacilosis y escherichiosis en terneros y cerdos, salmonelosis en pollos... Es especialmente conveniente utilizar preparaciones de fagos en el caso de acuicultura: para el tratamiento de peces y camarones criados industrialmente, ya que duran mucho tiempo en el agua. Los bacteriófagos también ayudan a proteger las plantas, aunque el uso de tecnologías de fagos en este caso es difícil debido a la influencia de factores naturales, como luz del sol y la lluvia, destructiva para los virus.

Los fagos pueden jugar gran papel en el mantenimiento de la seguridad microbiológica de los productos alimenticios, ya que el uso de antibióticos y agentes químicos en la industria alimentaria no soluciona este problema, al mismo tiempo que reduce el nivel de limpieza ambiental de los productos. La gravedad del problema en sí se evidencia en datos estadísticos: por ejemplo, en Estados Unidos y Rusia se registran anualmente hasta 40 mil casos de salmonelosis, de los cuales el 1% muere. La propagación de esta infección está asociada en gran medida con la cría, el procesamiento y el consumo de varios tipos de aves de corral, y los intentos de utilizar bacteriófagos para combatirla han mostrado resultados prometedores.

Sí, una empresa americana. Intralytix produce preparados de fagos para combatir la listeriosis, la salmonelosis y la contaminación bacteriana por E. coli. Están aprobados para su uso como aditivos que previenen el crecimiento de bacterias en los alimentos; se rocían sobre productos cárnicos y avícolas, así como sobre verduras y frutas. Los experimentos han demostrado que un cóctel de bacteriófagos se puede utilizar con éxito en el transporte y venta de peces vivos de estanque para reducir la contaminación bacteriana no sólo del agua, sino también de los propios peces.

Una aplicación obvia de los bacteriófagos es desinfección, es decir, la destrucción de bacterias en lugares donde no deberían estar: en hospitales, producción de alimentos, etc. Para ello, una empresa británica Fago fijo desarrolló un método para fijar preparaciones de fagos en superficies, asegurando la preservación de la actividad biológica de los fagos por hasta tres años.

Bacteriófagos - “drosophila” de la biología molecular

En 1946, en el undécimo simposio celebrado en el famoso laboratorio estadounidense de Cold Spring Harbor, se proclamó la teoría de "un gen, una enzima". El bacteriólogo A. Hershey y el “ex” físico y biólogo molecular M. Delbrück informaron sobre el intercambio de características genéticas entre varios fagos mientras infectaban simultáneamente células de E. coli. Este descubrimiento, realizado en un momento en que aún no se conocía el portador físico del gen, indicó que el fenómeno de la "recombinación" - mezcla rasgos genéticos, es característico no solo de los organismos superiores, sino también de los virus. El descubrimiento de este fenómeno permitió posteriormente estudiar en detalle mecanismos moleculares replicación. Posteriormente, los experimentos con bacteriófagos permitieron establecer los principios de estructura y funcionamiento de los programas genéticos.

En 1952, A. Hershey y M. Chase demostraron experimentalmente que la información hereditaria del bacteriófago T2 no está codificada en proteínas, como creían muchos científicos, sino en moléculas de ADN (Hershey y Chase, 1952). Los investigadores siguieron el proceso de reproducción en dos grupos de bacteriófagos, uno de los cuales portaba proteínas marcadas radiactivamente y el otro portaba moléculas de ADN. Después de la infección de bacterias con tales fagos, resultó que solo se transfirió ADN viral a la célula infectada, lo que sirvió como evidencia de su papel en el almacenamiento y transmisión de información hereditaria.

Ese mismo año, los genetistas estadounidenses D. Lederberg y N. Zindler, en un experimento con dos cepas de Salmonella y el bacteriófago P22, descubrieron que el bacteriófago es capaz de incorporar fragmentos de ADN de la bacteria huésped durante el proceso de reproducción y transmitirlos a otros. bacterias durante la infección (Zinder y Lederberg, 1952). Este fenómeno de transferencia de genes de una bacteria donante a una receptora se ha denominado "transducción". Los resultados del experimento fueron otra confirmación del papel del ADN en la transmisión de información hereditaria.

En 1969, A. Hershey, M. Delbrück y su colega S. Luria recibieron el premio Nobel “por sus descubrimientos sobre el mecanismo de replicación y la estructura genética de los virus”.

En 1972, R. Bird y sus colegas, al estudiar el proceso de replicación (copia de información celular) del ADN de E. coli, utilizaron bacteriófagos como sondas que podían integrarse en el genoma de una célula bacteriana y descubrieron que el proceso de replicación ocurre en dos direcciones a lo largo del cromosoma (Stent, 1974).

Siete días de creación

Los métodos modernos de biología sintética permiten no solo introducir diversas modificaciones en los genomas de los fagos, sino también crear fagos activos completamente artificiales. Tecnológicamente esto no es difícil, basta con sintetizar el genoma del fago e introducirlo en una célula bacteriana, y allí se iniciarán todos los procesos necesarios para la síntesis de proteínas y el ensamblaje de nuevas partículas de fagos. En los laboratorios modernos este trabajo sólo durará unos días.

Las modificaciones genéticas se utilizan para cambiar la especificidad de los fagos y aumentar la eficacia de sus efectos terapéuticos. Para ello, los fagos más agresivos están equipados con estructuras de reconocimiento que los unen a la bacteria objetivo. Además, en los genomas virales se insertan genes que codifican proteínas que son tóxicas para las bacterias y alteran el metabolismo; dichos fagos son más letales para las bacterias;

Las bacterias tienen varios mecanismos de defensa contra antibióticos y bacteriófagos, uno de los cuales es la destrucción de genomas virales. enzimas de restricción, actuando sobre secuencias de nucleótidos específicas. Para aumentar la actividad terapéutica de los fagos, debido a la degeneración del código genético, es posible "reformatear" las secuencias de sus genes de tal manera que se minimice el número de secuencias de nucleótidos "sensibles" a las enzimas, preservando al mismo tiempo sus propiedades de codificación.

Una forma universal de proteger las bacterias de todas las influencias externas: la llamada biopelículas, películas de ADN, polisacáridos y proteínas que las bacterias crean juntas y donde no penetran ni los antibióticos ni las proteínas terapéuticas. Estas biopelículas son dolor de cabeza Los médicos, ya que contribuyen a la destrucción del esmalte dental, se forman en la superficie de implantes, catéteres, articulaciones artificiales, así como en el tracto respiratorio, en la superficie de la piel, etc. Para combatir las biopelículas, se construyeron bacteriófagos especiales que contienen un gen que codifica una enzima lítica especial que destruye los polímeros bacterianos.

Enzimas “de bacteriófagos”

Como resultado de la investigación sobre bacteriófagos se descubrió una gran cantidad de enzimas, ahora ampliamente utilizadas en biología molecular e ingeniería genética.

Un ejemplo de ello son las enzimas de restricción, un grupo de nucleasas bacterianas que digieren el ADN. A principios de la década de 1950. Se descubrió que los bacteriófagos aislados de las células de una cepa de bacterias a menudo se reproducen mal en una cepa estrechamente relacionada. El descubrimiento de este fenómeno significó que las bacterias tenían un sistema para suprimir la reproducción de los virus (Luria & Human, 1952). Como resultado, se descubrió un sistema enzimático de modificación de restricción, con la ayuda del cual las bacterias destruyen el ADN extraño que había ingresado a la célula. El aislamiento de enzimas de restricción (endonucleasas de restricción) brindó a los biólogos moleculares una herramienta invaluable que les permitió manipular el ADN: insertar una secuencia en otra o cortar los fragmentos necesarios de la cadena, lo que finalmente condujo al desarrollo de tecnología para crear ADN recombinante.

Otra enzima ampliamente utilizada en biología molecular es la ADN ligasa del bacteriófago T4, que "entrecruza" los extremos "pegajosos" y "romos" de las moléculas de ADN y ARN de doble cadena. Y recientemente han aparecido versiones genéticamente modificadas de esta enzima con mayor actividad.

La mayoría de las ARN ligasas utilizadas en la práctica de laboratorio, que "entrecruzan" moléculas de ARN y ADN monocatenarias, también se originan a partir de bacteriófagos. En la naturaleza, sirven principalmente para reparar moléculas de ARN rotas. Los investigadores suelen utilizar la ARN ligasa del bacteriófago T4, que se puede utilizar para "coser" polinucleótidos monocatenarios en moléculas de ARN para etiquetarlas. Esta técnica se utiliza para analizar la estructura del ARN, buscar sitios de unión del ARN con proteínas, síntesis de oligonucleótidos, etc. Recientemente, entre las enzimas utilizadas habitualmente han aparecido ARN ligasas termoestables aisladas de los bacteriófagos rm378 y TS2126 (Nordberg Karlsson, et al. , 2010; Hjorleifsdóttir, 2014).

Algunos de otro grupo también se obtienen de bacteriófagos extremadamente enzimas importantes- polimerasas. Por ejemplo, la ADN polimerasa muy "precisa" del bacteriófago T7, que ha encontrado aplicación en diversos campos de la biología molecular, como la mutagénesis dirigida, pero que se utiliza principalmente para determinar estructura primaria ADN.

La ADN polimerasa del fago T7 modificada químicamente se propuso como una herramienta ideal para la secuenciación de ADN ya en 1987 (Tabor y Richardson, 1987). La modificación de esta polimerasa ha aumentado varias veces su eficacia: la velocidad de polimerización del ADN alcanza más de 300 nucleótidos por segundo, por lo que puede utilizarse para amplificar grandes fragmentos de ADN. Esta enzima se convirtió en la precursora de la sequenasa, una enzima diseñada genéticamente y optimizada para la secuenciación del ADN en la reacción de Sanger. La secuenciasa es altamente eficiente y tiene la capacidad de incorporar análogos de nucleótidos en la secuencia de ADN, que se utilizan para mejorar los resultados de la secuenciación.

Las principales ARN polimerasas (ARN polimerasas dependientes de ADN) utilizadas en biología molecular, enzimas que catalizan el proceso de transcripción (lectura de copias de ARN a partir de una plantilla de ADN), también se originan a partir de bacteriófagos. Estos incluyen las ARN polimerasas SP6, T7 y T3, que llevan el nombre de los bacteriófagos correspondientes SP6, T7 y T3. Todas estas enzimas se utilizan para la síntesis in vitro de transcritos de ARN antisentido, sondas de ARN marcadas, etc.

El primer genoma de ADN completamente secuenciado fue el genoma del fago φ174, de más de 5.000 nucleótidos de longitud (Sanger et al., 1977). Esta decodificación fue realizada por el grupo del bioquímico inglés F. Sanger, creador del famoso método de secuenciación de ADN del mismo nombre.

Las polinucleótido quinasas catalizan la transferencia de un grupo fosfato de una molécula de ATP al extremo 5' de una molécula de ácido nucleico, el intercambio de grupos 5'-fosfato o la fosforilación de los extremos 3' de los mononucleótidos. En la práctica de laboratorio, la polinucleótido quinasa más utilizada es el bacteriófago T4. Se utiliza comúnmente en experimentos para marcar el ADN con un isótopo radiactivo de fósforo. La polinucleótido quinasa también se utiliza para encontrar sitios de restricción, huellas dactilares de ADN y ARN y sintetizar sustratos para ligasas de ADN o ARN.

En experimentos de biología molecular, se utilizan enzimas de bacteriófagos como la polinucleótido quinasa del fago T4, que normalmente se utiliza para marcar ADN con un isótopo de fósforo radiactivo, huellas dactilares de ADN y ARN, etc., así como enzimas que escinden ADN, que se utilizan para obtener ADN monocatenario. Las plantillas también se utilizan ampliamente en experimentos de biología molecular para la secuenciación y el análisis del polimorfismo de nucleótidos.

Utilizando métodos de biología sintética, fue posible desarrollar bacteriófagos armados con las armas más sofisticadas que utilizan las bacterias contra los propios fagos. Estamos hablando de sistemas bacterianos CRISPR-Cas, que son un complejo de una enzima nucleasa que escinde el ADN y una secuencia de ARN que dirige la acción de esta enzima sobre un fragmento específico del genoma viral. Un fragmento de ADN del fago, que la bacteria almacena como “memoria” en un gen especial, sirve como “puntero”. Cuando se encuentra un fragmento similar dentro de una bacteria, este complejo proteína-nucleótido lo destruye.

Habiendo comprendido el mecanismo de funcionamiento de los sistemas CRISPR-Cas, los investigadores intentaron equipar a los propios fagos con "armas" similares, para lo cual introdujeron en su genoma un complejo de genes que codifican una nucleasa y se dirigen a secuencias de ARN complementarias a regiones específicas de el genoma bacteriano. El “objetivo” pueden ser los genes responsables de la resistencia a múltiples fármacos. Los experimentos fueron un completo éxito: estos fagos atacaron con gran eficacia a las bacterias con las que estaban "sintonizados".

Antibióticos fagos

EN fines terapéuticos No es necesario utilizar los fagos directamente. Durante millones de años de evolución, los bacteriófagos han desarrollado un arsenal de proteínas específicas: herramientas para reconocer microorganismos objetivo y manipular los biopolímeros de la víctima, a partir de las cuales se pueden crear fármacos antibacterianos. Las proteínas más prometedoras de este tipo son las enzimas endolisinas, que los fagos utilizan para destruir la pared celular al abandonar la bacteria. Estas sustancias en sí mismas son poderosos agentes antibacterianos que no son tóxicos para los humanos. La eficacia y la dirección de su acción se pueden aumentar cambiando sus estructuras de direccionamiento: proteínas que se unen específicamente a determinadas bacterias.

La mayoría de las bacterias se dividen según la estructura de su pared celular en grampositivas, cuya membrana está cubierta por una capa muy gruesa de peptidoglicano, y gramnegativas, en las que una capa de peptidoglicano se encuentra entre dos membranas. El uso de endolisinas naturales es especialmente eficaz en el caso de bacterias grampositivas (estafilococos, estreptococos, etc.), ya que su capa de peptidoglicano se sitúa en el exterior. Las bacterias gramnegativas (Pseudomonas aeruginosa, Salmonella, Escherichia coli, etc.) son un objetivo menos accesible, ya que la enzima debe atravesar la membrana bacteriana externa para llegar a la capa interna de peptidoglicano.

Para superar este problema, se crearon las llamadas artilisinas, versiones modificadas de endolisinas naturales que contienen péptidos policatiónicos o anfipáticos que desestabilizan la membrana externa y aseguran la entrega de endolisina directamente a la capa de peptidoglicano. Las artilisinas tienen una alta actividad bactericida y ya han demostrado su eficacia en el tratamiento de la otitis media en perros (Briers et al., 2014).

Un ejemplo de endolisina modificada que actúa selectivamente sobre determinadas bacterias es el fármaco P128 de una empresa canadiense. GangaGen Inc.. Es un fragmento biológicamente activo de endolisina combinado con lisostafina, una molécula de proteína dirigida que se une a la superficie de las células estafilocócicas. La proteína quimérica resultante tiene alta actividad contra diferentes cepas estafilococos, incluidos aquellos con resistencia a múltiples fármacos.

"Contadores" de bacterias

Los bacteriófagos sirven no sólo como un agente terapéutico y "desinfectante" versátil, sino también como una herramienta analítica conveniente y precisa para un microbiólogo. Por ejemplo, debido a su alta especificidad, son reactivos analíticos naturales para identificar bacterias de un determinado tipo y cepa.

En la versión más sencilla de un estudio de este tipo, se añaden gota a gota varios bacteriófagos de diagnóstico a una placa de Petri con un medio nutritivo sembrado con un cultivo bacteriano. Si la bacteria resulta ser sensible al fago, entonces se formará una "placa" en este lugar del "césped" bacteriano, un área transparente con células bacterianas muertas y lisadas.

Analizando la reproducción de fagos en presencia de bacterias diana, es posible cuantificar el número de estas últimas. Dado que el número de partículas de fagos en una solución aumentará en proporción al número de células bacterianas que contiene, para estimar el número de bacterias basta con determinar el título del bacteriófago.

La especificidad y sensibilidad de dicha reacción analítica son bastante altas y los procedimientos en sí son simples de realizar y no requieren equipos complejos. Es importante que los sistemas de diagnóstico basados ​​en bacteriófagos indiquen la presencia de un patógeno vivo, mientras que otros métodos, como la PCR y los métodos inmunoanalíticos, indiquen únicamente la presencia de biopolímeros que pertenecen a esta bacteria. Este tipo de métodos de diagnóstico es especialmente conveniente para su uso en estudios ambientales, así como en la industria alimentaria y la agricultura.

Ahora a identificar y cuantificación diferentes cepas de microorganismos utilizan especiales especies de referencia fagos. Se pueden crear sistemas analíticos muy rápidos, casi en tiempo real, basados ​​en bacteriófagos genéticamente modificados que, cuando ingresan a una célula bacteriana, desencadenan la síntesis de proteínas fluorescentes (o luminiscentes) reporteras, como luciferasa. Cuando se agregan los sustratos necesarios a dicho medio, aparecerá una señal luminiscente, cuyo valor corresponde al contenido de bacterias en la muestra. Estos fagos "marcados con luz" se han desarrollado para detectar patógenos peligrosos- patógenos de peste, ántrax, tuberculosis e infecciones de plantas.

Es probable que con la ayuda de fagos modificados sea posible resolver un antiguo problema de importancia mundial: desarrollar productos baratos y métodos rápidos detección de patógenos de la tuberculosis etapa temprana enfermedades. Esta tarea es muy difícil, ya que las micobacterias, causando tuberculosis, difieren extremadamente crecimiento lento cuando se cultiva en condiciones de laboratorio. Por lo tanto, el diagnóstico de la enfermedad mediante métodos tradicionales puede retrasarse hasta varias semanas.

La tecnología de fagos facilita esta tarea. Su esencia es que a las muestras de sangre analizadas se añade el bacteriófago D29, que es capaz de infectar una amplia gama de micobacterias. Luego se separan los bacteriófagos y la muestra se mezcla con un cultivo de micobacterias no patógeno de rápido crecimiento que también es sensible a este bacteriófago. Si inicialmente la sangre contenía micobacterias infectadas con fagos, en el nuevo cultivo también se observará la producción de bacteriófagos. De esta manera, se pueden detectar células micobacterianas individuales y el proceso de diagnóstico en sí se reduce de 2 a 3 semanas a 2 a 5 días (Swift & Rees, 2016).

visualización de fagos

Hoy en día, los bacteriófagos también se utilizan ampliamente como sistemas simples para la producción de proteínas con propiedades específicas. Estamos hablando de uno desarrollado en los años 1980. técnica de reproducción molecular extremadamente eficaz - visualización de fagos. Este término fue propuesto por el estadounidense J. Smith, quien demostró que a partir de bacteriófagos de E. coli es posible crear un virus modificado viable que lleve una proteína extraña en su superficie. Para ello, se introduce en el genoma del fago el gen correspondiente, que se fusiona con el gen que codifica una de las proteínas virales de superficie. Estos bacteriófagos modificados se pueden aislar a partir de una mezcla con fagos de tipo salvaje debido a la capacidad de la proteína "extraña" para unirse a anticuerpos específicos (Smith, 1985).

De los experimentos de Smith se derivaron dos conclusiones importantes: en primer lugar, utilizando tecnología de ADN recombinante, es posible crear poblaciones enormemente diversas de 10 6 -10 14 partículas de fagos, cada una de las cuales lleva en su superficie diferentes opciones proteínas. Estas poblaciones fueron llamadas bibliotecas combinatorias de fagos. En segundo lugar, al aislar un fago específico de una población (por ejemplo, uno que tiene la capacidad de unirse a una proteína o molécula orgánica específica), este fago se puede propagar en células bacterianas y obtener un número ilimitado de descendientes con propiedades específicas.

Con la ayuda de la presentación en fagos, ahora se producen proteínas que pueden unirse selectivamente a objetivos terapéuticos, por ejemplo, los que se muestran en la superficie del fago M13, que son capaces de reconocer e interactuar con las células tumorales. La función de estas proteínas en la partícula del fago es "empaquetar" el ácido nucleico, por lo que son muy adecuadas para crear medicamentos de terapia génica, solo que en este caso forman una partícula con un ácido nucleico terapéutico.

Hoy en día, existen dos áreas principales de aplicación de la presentación en fagos. La tecnología basada en péptidos se utiliza para estudiar receptores y mapear sitios de unión de anticuerpos, crear inmunógenos y nanovacunas y mapear sitios de unión de sustratos de proteínas enzimáticas. Tecnología basada en proteínas y dominios proteicos: para seleccionar anticuerpos con propiedades específicas, estudiar interacciones proteína-ligando, detectar fragmentos expresados ​​de ADN complementario y modificaciones específicas de proteínas.

Utilizando la presentación en fagos, es posible introducir grupos de reconocimiento en todo tipo de proteínas virales de superficie, así como en la proteína principal que forma el cuerpo del bacteriófago. Introduciendo péptidos con propiedades específicas en proteínas de superficie, es posible obtener toda una gama de valiosos productos biotecnológicos. Por ejemplo, si este péptido imita una proteína de un virus o bacteria peligrosos, reconocibles sistema inmunitario Entonces, un bacteriófago modificado de este tipo es una vacuna que puede producirse de forma sencilla, rápida y segura.

Si la proteína de superficie terminal del bacteriófago se "dirige" a las células cancerosas y los grupos indicadores (por ejemplo, fluorescentes o magnéticos) se unen a otra proteína de superficie, entonces se obtendrá una herramienta para detectar tumores. Y si además le sumamos a la partícula fármaco citotóxico(y la química bioorgánica moderna hace que esto sea fácil), entonces obtendrá un medicamento que actúa específicamente sobre las células cancerosas.

uno de aplicaciones importantes El método de presentación de proteínas en fagos es la creación de bibliotecas de fagos de anticuerpos recombinantes, donde se ubican fragmentos de inmunoglobulinas que se unen a antígenos en la superficie de las partículas de fagos fd o M13. Las bibliotecas de anticuerpos humanos son de particular interés, ya que tales anticuerpos pueden usarse en terapia sin limitación. EN últimos años Sólo en el mercado farmacéutico estadounidense se venden alrededor de una docena y media. anticuerpos terapéuticos, construido utilizando este método.

Fagos "industriales"

La metodología de presentación en fagos también ha encontrado una aplicación completamente inesperada. Después de todo, los bacteriófagos son, ante todo, partículas nanométricas de una determinada estructura, en cuya superficie se encuentran proteínas que, mediante la visualización en fagos, pueden "equiparse" con las propiedades de unirse específicamente a las moléculas deseadas. Estas nanopartículas abren enormes oportunidades para crear materiales con una arquitectura determinada y nanodispositivos moleculares "inteligentes", y sus tecnologías de producción serán respetuosas con el medio ambiente.

Dado que el virus es una estructura bastante rígida con una determinada relación dimensional, esta circunstancia permite utilizarlo para obtener nanoestructuras porosas con área conocida superficie y la distribución deseada de poros en la estructura. Como se sabe, es la superficie del catalizador el parámetro crítico que determina su eficiencia. Y las tecnologías que existen hoy para formar una fina capa de metales y sus óxidos en la superficie de los bacteriófagos permiten obtener catalizadores con una superficie regular extremadamente desarrollada de una determinada dimensión. (Lee et al., 2012).

El investigador del MIT A. Belcher utilizó el bacteriófago M13 como plantilla para el crecimiento de nanopartículas y nanocables de rodio y níquel en la superficie del óxido de cerio. Las nanopartículas catalizadoras resultantes promueven la conversión de etanol en hidrógeno, por lo que este catalizador podría ser muy útil para mejorar las pilas de combustible de hidrógeno existentes y crear nuevas. Un catalizador cultivado sobre una plantilla de virus se diferencia de un catalizador "normal" con una composición similar en su mayor estabilidad, es menos susceptible al envejecimiento y a la desactivación de la superficie (Nam et al. . , 2012).

Al recubrir fagos filamentosos con oro y dióxido de indio, se obtuvieron materiales electrocrómicos: nanopelículas porosas que cambian de color al cambiar. campo eléctrico, capaz de responder a cambios en el campo eléctrico una vez y media más rápido que sus homólogos conocidos. Materiales de este tipo son prometedores para crear dispositivos con pantallas ultrafinas que ahorren energía (Nam et al., 2012).

En el MIT, los bacteriófagos se han convertido en la base para la producción de baterías eléctricas muy potentes y extremadamente compactas. Para ello utilizamos fagos M13 vivos genéticamente modificados, que no son peligrosos para los humanos y son capaces de fijar iones de diversos metales a la superficie. Como resultado del autoensamblaje de estos virus, se obtuvieron estructuras de una configuración determinada que, al recubrirse con metal, formaban nanocables suficientemente largos que se convirtieron en la base del ánodo y el cátodo. Durante la autoformación del material del ánodo se utilizó un virus capaz de unir oro y óxido de cobalto; para el cátodo se utilizó un virus capaz de unir fosfato de hierro y plata. Este último fago también tenía la capacidad, mediante reconocimiento molecular, de "recoger" los extremos de un nanotubo de carbono, lo cual es necesario para una transferencia eficiente de electrones.

También se han creado materiales para células solares a base de complejos de bacteriófago M13, dióxido de titanio y nanotubos de carbono de pared simple (Dang et al., 2011).

Los últimos años se han caracterizado por una extensa investigación sobre los bacteriófagos, que están encontrando nuevas aplicaciones no sólo en terapia, sino también en bio y nanotecnología. su obvio resultado práctico Debería ser el surgimiento de una nueva y poderosa dirección de la medicina personalizada, así como la creación de toda una gama de tecnologías en industria alimentaria, medicina veterinaria, agricultura y en la producción de materiales modernos. Esperamos que el segundo siglo de investigación sobre bacteriófagos traiga no menos descubrimientos que el primero.

Literatura
1. Bacteriófagos: biología y aplicación / Ed.: E. Cutter, A. Sulakvelidze. M.: Mundo científico. 2012.
2. Stent G., Kalindar R. Genética molecular. M.: Mir. 1974. 614 pág.
3. Tikunova N.V., Morozova V.V. Visualización de fagos basada en bacteriófagos filamentosos: aplicación para la selección de anticuerpos recombinantes // Actas naturales. 2009. No. 3. P. 6-15.
4. Mc Grath S., van Sinderen D. Bacteriófagos: genética y biología molecular. Prensa científica Horizonte, 2007.